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将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
UOR职位描述和人员规格 - 工作@Reading
•具有适当的荧光标记物的电压门控钙通道CACNA1C和CACNA1B同工型的瞬时转染稳定或瞬时表达VGCC和22亚基，用于形成功能通道所必需的SHEK293细胞。•表现出感兴趣变化的同工型将作为可诱导的稳定转染细胞系产生，以进行进一步的实验。•体外电生理学（全细胞贴片夹记录）测量生物物理参数，包括电压敏感性，电导和激活/失活动力学。•使用接近连接测定和细胞表面生物素化来鉴定新型相互作用蛋白，以测定离子通道运输到膜上。•使用包括L型钙通道的选择性阻断剂在内的一系列药物进行了VGCC蛋白质成型的药理学的解剖。•分析描述性数据，数字图像和遗传数据的电生理学，蛋白质生物化学和药理学数据集•数据交流和写作研究论文手稿。
翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
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将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
通过电荷检测质谱法分析AAV提取的DNA揭示了基因组截断
摘要：腺相关病毒（AAV）是一种广泛使用的基因治疗载体。完整包装的基因组是有效治疗的关键质量属性，是必要的。在这项工作中，使用电荷检测质谱法（CDM）来测量从重组AAV（RAAV）向量提取的感兴趣基因组（GOI）的分子量（MW）分布。将测得的MWS与具有不同的Gois，血清型和生产方法（SF9和HEK293细胞系）的RAAV载体的序列质量进行了比较。在大多数情况下，测得的MW略大于序列质量，结果归因于柜台。但是，在少数情况下，测得的MW明显小于序列质量。在这些情况下，基因组截断是差异的唯一合理解释。这些结果表明，CDM对提取的GOI的直接分析提供了一种快速而有力的工具，可以评估基因组完整性中的基因组完整性。■简介
用于基于 qPCR 的基因编辑的 CRISPY™ Master Mix ...
我们使用 All-in-one Cas9 构建体编辑了 HEK293 细胞中的 DNA (胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 3 beta (DNMT3B) 基因，从编辑后的细胞中分离基因组 DNA，然后使用标准 (黄色曲线) 和 snapback 引物 (红色曲线，图 2A) 进行 CRISPY 测定以量化编辑成功率。我们还对从未编辑的细胞中分离的 DNA 进行了 CRISPY 测定，同样使用标准 (黄色曲线) 和 Snapback 引物 (红色曲线，图 2B)。正如预期的那样，标准引物在编辑和未编辑的 DNA 中均提供了强大的扩增，然而 snapback 引物仅在从编辑细胞中分离的 DNA 中提供了明显的扩增。标准和 snapback 引物之间的 ΔCt 可直接测量编辑成功率，而熔解曲线形状之间的差异表明编辑的 DNA 中存在缺失 (图 2C，方框区域)。
一个细胞竞争系统，具有一个基因表达的单拷贝基因中的一个基因
即使使用晚期质粒和病毒载体，在不同转染的细胞中获得多个基因的拷贝数也很具有挑战性。，我们使用转基因竞争系统，Kazusa cDNA克隆和我们的双重重组酶介导的盒式盒式交换系统的组合从一个细胞中的单拷贝基因中实现了一个基因表达。使用该系统在HEK293中同时在同一表达水平中同时表达了所有48个核受体，并比较了细胞增殖速率。在8周后用CMV-或EF1启动子驱动子驱动的表达转染的细胞之间观察到显着差异。EF1-NR1I2细胞系从2周到8周增长，比EF1-DSRED线高1.13倍。另一方面，EF1-NR4A1细胞系在8周时显示最大减少，比EF1-DSRED线低0.88倍。在我们的转基因竞争系统和长期增长实验中证实了结果。我们的转基因竞争系统提供了广泛，简单且准确的细胞竞争方法。
Lentipool V2人CRISPR库 - 用户指南实现特定于目标效率-truecut-hifi-cas9-
为了更好地了解Truecut Hifi Cas9的高保真度，我们评估了HEK293基因组中的其他基因。使用TEG-Seq进行了更多全基因组筛查，以检测HEK1，HEK4，VEG1和VEG3基因中的靶标。数据表明，Truecut Hifi Cas9比WT-CAS9和供应商I高保真CAS9蛋白产生的脱离目标较少（图1）。将每个编辑位点的脱靶编辑百分比与靶向编辑的百分比进行了比较，以确定相应站点的脱靶/靶向概率比。每个编辑事件均与其概率比（图1A）绘制，并根据概率将OFF目标的总数分组（图1B）。结果表明，与WT-CAS9和供应商I高保真CAS9相比，Truecut Hifi Cas9产生的脱靶编辑明显少得多。truecut hifi cas9只有一个非目标编辑的概率> 10％。相比之下，WT-CAS9和供应商I高保真CAS9分别具有16和6折叠目标（图1B）。
CRISPR 介导的 EGFR 过表达消融与舒尼替尼联合可显著抑制肾细胞癌增殖
受体酪氨酸激酶，如 VEGFR、PDGFR 和 EGFR，在肾癌中起着重要作用。在本研究中，我们研究了 EGFR 敲除作为肾细胞癌 (RCC) 的治疗方法。我们发现，与其他常用细胞系（如 HEK293、A549、Hela 和 DLD1）相比，肾细胞癌细胞系 (RC21) 的 EGFR 表达更高。通过 CRISPR/Cas9 消融 EGFR 可显著抑制肿瘤细胞生长并激活 MAPK（pERK1/2）通路。VEGFR 和 PDGFR 抑制剂舒尼替尼可减弱 EGFR 缺失诱导的 MAPK（pERK1/2）和 pAKT 表达，并进一步抑制 EGFR -/- 细胞增殖。我们发现 EGFR 的缺失最终会导致对 SAHA 和顺铂的耐药性。此外，EGFR缺失可诱导G2/M期停滞，并导致肾细胞癌对TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）的抵抗力增强。因此，单独使用CRISPR/Cas9或与舒尼替尼联合消融过表达的EGFR可能是肾细胞癌的新治疗选择。
蛋白质靶向药物的普遍转录组相互作用
核糖体 RNA 的 OH 甲基化。此外，RBRP 能够以核苷酸水平的精度映射含有 poly(A) 尾的 ~16,000 个 RNA 上的结合位点，并揭示 RNA-药物结合、RNA 结合蛋白 (RBP) 以及 RNA 结构可及性和动力学之间的复杂相互作用。结果与讨论 RBRP 解码体内蛋白质靶向小分子药物的转录组相互作用。我们的分析方法涉及使用细胞通透性的 RNA 酰化探针（采用酰基咪唑取代的连接子在 RNA 2′-OH 基团处发生反应）来评估和量化药物结合细胞 RNA 的趋势（图 1d）。药物的酰基咪唑缀合物与结构化 RNA 或蛋白质-RNA 界面的结合应导致酰化 2′-OH 在药物结合位点附近富集。我们通过修改体内 RNA 映射协议 20、通过 poly(A) 下拉分析信使 RNA (mRNA) 和非编码 RNA (ncRNA) 并对得到的文库进行高深度测序（每个重复>1100 万个读取）来识别这种结合促进的酰化。具体而言，RNA 药物结合位点富含酰化的 2′-OH 基团，这会导致逆转录酶 (RT) 停止。这些停止通过生物素介导的下拉 20 和与未修饰药物的竞争在随机 RNA 断裂和随机位点反应中富集。这种比较工作流程使我们能够在整个细胞 RNA 群体中精确定位和量化结合位置；只有与未修饰药物表现出竞争的位点才被评为真正的药物结合位点。RBRP 揭示了羟氯喹 (HCQ) 的转录组相互作用。作为对小分子药物体内转录组相互作用的初步评估，我们在人胚胎肾细胞 HEK293 中使用含有叠氮基“点击”手柄的药物羟氯喹 (HCQ) 的酰基咪唑缀合物进行了 RBRP 实验原型 (图 2a-b)。HCQ 最初被批准用于治疗疟疾，最近被研究用于治疗 COVID-19 感染，已知会导致原因不明的视网膜病变和心肌病 21,22。鉴于其融合的芳香环和正电荷，以及它与已知 RNA 结合剂的结构相似性，其结构表明可能对折叠 RNA 具有亲和力 (图 2a，右图)。为了测试这种可能性，我们在没有或存在过量竞争药物 (未修饰的 HCQ) 的情况下用 HCQ 的酰化类似物 (HCQ-AI，图 2b) 处理 HEK293 细胞 30 分钟，并对 poly(A)+ 转录本进行 RBRP。我们使用 icSHAPE 管道 20,23（读取深度= 200 作为阈值）来