XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemHEK293
DNA目标关联中金黄色葡萄球菌Cas9的动力学
摘要尽管医疗保健方面取得了进步，但癌症仍然对人类健康的主要威胁。抗体 - 药物结合物（ADC）是一种有希望的靶向疗法，可以克服对正常组织的不良副作用。在这一领域，当前的挑战是获得偶联物的均匀制剂，其中定义数量的药物与特定的抗体位点结合。基于网站的半胱氨酸共轭通常用于获得同质ADC，但由于需要广泛的抗体工程来确定最佳结合位点和还原 - 氧化方案是每种抗体的特异性，因此这是一种耗时且昂贵的方法。因此，需要对已经批准的抗体疗法提供同质性和直接适用性的ADC平台。在这里，我们用曲妥珠单抗作为模型来描述一种从任何人类免疫球蛋白1（IgG 1）中得出2（IgG 1）的药物与抗体比为2的均质ADC的新方法。该方法基于两个重组HEK293独立培养物中重链（HC）和轻链（LC）的产生，因此未改变原始的氨基酸序列。分离的LC有效地连接到单个药物链链（VCMMAE）构建体并混合到分离的HC二聚体，以获得正确折叠的ADC。根据ADC同质性（HIC-HPLC，MS），纯度（SEC-HPLC），孤立的抗原识别（ELISA）和生物学活性（HER2阳性乳腺癌细胞细胞毒性测定）对工作的相关性进行了验证。
简介1。材料和方法2。Iline-f Pro Machine ...
虽然细胞和基因疗法（C＆GT）在诊所中获得了一些显着的成功，但这些疗法的制造过程仍然具有挑战性且昂贵。C＆GT中使用的病毒载体的瞬时产生，例如Adeno相关病毒（AAV），取决于一致的上游过程，用于批处理可重复性。可以通过适当访问可行和总细胞密度（例如总细胞密度）的过程来使这种一致性成为可能。Iline F Pro（Ovizio）是一种自动细胞分析仪，可通过在线生物反应器连接监测细胞动力学。我们评估了iLine f Pro作为AAV产品制造规模生物反应器中实时HEK293培养监测的工具。用于未转染和转染的细胞的Iline F Pro和VI-Cell XR之间的细胞密度与生存能力之间的良好相关性。开发的算法可用于新实验，以不含标签和在线方式复制VI细胞计数。可以利用Iline F Pro的频繁测量（每小时1个）来预测何时达到转染的目标细胞浓度。转染后，鉴定出可能与转染的细胞种群相对应的新细胞群体。对该人群的监视将允许实时访问转染效率。总而言之，我们强调了在线监测细胞培养的高潜力，作为提高过程理解，在开发阶段至关重要的工具，以及迈向过程自动化的第一步。
一种基于体外和体内建模的靶向尿酸转运蛋白1的新型尿素的系统
摘要：高尿酸血症已成为全球负担，随着相关代谢性疾病和心血管疾病的越来越多的患病率和风险。尿液疗法通过通过肾脏促进尿酸排泄，作为降低尿酸盐的重要疗法。但是，有效且安全的尿液疗法仍在迫切需要在诊所使用。在这项研究中，我们旨在建立体外和体内模型，以帮助发现新型的尿液治疗，并寻找有效的活性化合物，尤其是针对尿酸盐转运蛋白1（URAT1），这是肾脏处理尿酸稳态的主要尿酸盐转运蛋白。结果，对于初步筛选，使用非同位素尿酸摄取测定法在Hurat1稳固表达的HEK293细胞中评估了体外URAT1转运活性。在亚急性高尿症小鼠模型（亚hua）中评估了体内治疗效果，并在慢性高尿症小鼠模型（CH-HUA）中进一步确认。通过利用这些模型，获得化合物CC18002作为有效的URAT1抑制剂，IC 50值为1.69 µm，在亚hua和Ch-Hua小鼠中且降低的尿酸降低效应，与同一剂量的本茨溴酮相当。此外，CC18002处理不会改变黄嘌呤氧化还原酶（关键酶催化尿酸合成）的活性。综上所述，我们开发了一种新颖的筛选系统，包括针对URAT1的细胞模型和两种小鼠模型，以发现新型的尿液治疗。利用该系统，研究了化合物CC18002作为候选URAT1抑制剂治疗高尿酸血症。
MIRAGE 综合征的基础研究，旨在开发治疗策略 MIRAGE 综合征是最近发现的一种遗传性疾病，
对 MIRAGE 综合征进行基础研究以开发治疗策略 MIRAGE 综合征是一种最近发现的遗传性疾病，其特点是六个主要特征，包括骨髓发育不良、感染、生长受限、肾上腺发育不全、生殖器表型和肠病。“MIRAGE”是这六个特征的首字母缩写。MIRAGE 综合征是由 SAMD9 突变引起的，该突变编码一种功能未知的蛋白质。MIRAGE 综合征是一种罕见/难治性疾病。日本仅发现 11 名患者。MIRAGE 综合征是一种危及生命的疾病，事实上，超过一半的患者在 2 岁前死亡。我们开展“对 MIRAGE 综合征进行基础研究以开发治疗策略”的研究旨在获得有关 MIRAGE 综合征的基本知识和见解，从而有助于开发治疗方法。成海聪（国立儿童保健与发育研究所分子内分泌科主任）建立了 MIRAGE 综合征的 HEK293 细胞模型，研究人员可以通过该模型重现患者细胞的生长受限情况。利用该模型，他测试了大约 1,500 种之前鉴定的小化合物，以寻找治疗 MIRAGE 综合征的潜在药物。然而，在初步筛选中尚未发现任何有效的化合物。目前，SAMD9 的功能在很大程度上尚不清楚。鉴定 SAMD9 的功能对于阐明 MIRAGE 综合征的分子机制至关重要。为此，成海聪和金仓耕介（东京医科大学分子病理学系助理教授）开始了两种基于细胞的实验。一种是蛋白质组学筛选。在该实验中，以上述 MIRAGE 综合征的 HEK293 细胞模型的细胞提取物为对象，用抗体偶联树脂捕获 SAMD9，并寻找与 SAMD9 结合的分子。已确定了几种候选分子，目前正在验证中。另一个是基因组学筛选。Narumi 和 Kanekura 使用基因编辑技术应用了一种新的基因敲除筛选方法，现在正试图确定负责 SAMD9 功能的生物学途径。基于细胞的方法对于研究 MIRAGE 综合征的分子和细胞水平发病机制是有效的。另一方面，这些方法不适合阐明器官和身体水平的发病机制。它需要对 MIRAGE 综合征患者进行深入表征，并重现该疾病的动物模型。为了对患者进行深入分析，Tomonobu Hasegawa（庆应义塾大学医学院儿科教授）与日本儿科内分泌学会和日本新生儿健康与发展学会一起开始了全国性的 MIRAGE 综合征调查。这项调查将有助于找到更多患者，并将有助于阐明该综合征的临床表现。此外，为了建立MIRAGE综合征的动物模型，木下昌人（京都大学农学研究科应用生物科学系助理教授）和谷口义人（预防医学和公共卫生系教授）正在培育基因工程的青鳉（Medaka）。石井智宏（庆应义塾大学医学院儿科助理教授）也在培育基因工程小鼠。今年，靶向载体的构建已经完成。这些实验将在明年建立突变动物系。
gpr125（adgra3）是一种可启动的粘附GPCR，它以DLG1运输到基底外侧膜，并调节上皮层状极性
G蛋白 - 偶联受体（GPCR）的粘附家族由N末端较大的细胞外区域定义，该区域包含各种与粘附相关的结构域和高度保守的GPCR-Autoprototepotepotepotepotion-apoprotey-oprotote-oprotote-oprotote-oprotote-oprote-oprote-oprote-oprote-oprote-oprote-oprote-opersy-to诱导（增益）结构域，后者是位于典型的七跨透明型跨型跨型跨型跨型跨型跨型区域的后者。这些受体被广泛表达，并参与了各种功能，包括发育，血管生成，突触形成和肿瘤发生。gpr125（ADGRA3）是孤儿粘附GPCR，已显示可调节胃部胃肠杆中的平面细胞极性，但其生化特性和在哺乳动物细胞中的作用仍然很少仍然未知。在这里，我们表明，当在犬肾上皮MDCK细胞和人类胚胎肾Hek293细胞中表达时，人类GPR125可能会经历顺式蛋白质解。在受体生物合成的早期阶段，裂解似乎发生在增益域内的非典型GPCR蛋白水解位点。产品，即，N-ter-minal和c末端片段似乎在自蛋白解析后保持相关，如其他粘附GPCR所观察到的。此外，在极化MDCK细胞中，GPR125专门募集到质膜的基底外侧结构域。募集可能需要C末端PDZ障碍 - GPR125的结合基序及其与细胞蛋白DLG1的相互作用。敲低的GPR125以及DLG1的敲低导致在MDCK细胞的Matrigel 3D培养物中形成具有多个Lu-ens的异常囊肿。与多弹性表型一致，在GPR125 -KO MDCK细胞中，有丝分裂的纺锤体在囊肿发生过程中不正确。因此，基底外侧蛋白GPR125是一种可自启动的Adhe-Sion GPCR，似乎在上皮细胞中的脂质极性中起着至关重要的作用。
adar1（e1008q），标志标准重组
描述：重组人全长ADAR1（腺苷脱氨酶，RNA特异性1）转录本1，包含氨基酸2-1226（END）。该蛋白质包含感兴趣的突变E1008Q。此构造包含一个N末端标记标签。重组蛋白具有亲和力纯化。背景：ADAR1（腺苷脱氨酶，RNA特异性1）对RNA中的腺苷进行腺苷进行腺苷，尤其是针对位于特定茎环基序结构中的腺苷。有人提出，ADAR进化为为转录组提供额外的多样性，而大多数ADAR编辑事件发生在非编码RNA中，但其中一些（包括规范GLUA2编辑位点）改变了编码蛋白的氨基酸序列。adar1通过缓解干扰素信号传导在先天免疫中起作用。ADAR1功能障碍会导致自身免疫性疾病，并影响癌细胞的生长和增殖以及对免疫疗法的肿瘤反应。由于ADAR识别双链RNA，因此抑制或修饰RNA病毒的功能也起作用。因此，它与病毒进化和病毒变体（例如SARS-COV-2变体）的出现有关。已经提出了ADAR1的E1008Q突变体比其野生型具有更高的编辑活性，其突变存在于蛋白质的脱氨酶结构域中的高度保守的谷氨酸盐中。物种：人类结构：ADAR1（E1008Q）（FLAG-2-1226（END））浓度：0.39 mg/ml表达系统：HEK293纯度：80％格式：水缓冲液溶液。MW：137 KDA GenBank登录：NM_001111稳定性：-80°C至少6个月。以：50 mM Tris-HCl，pH 8.0、750 mm NaCl，0.01％Triton X-100、10％甘油和100μg/ml的FLAG肽。存储：-80°C使用的说明：在冰上解冻，并在使用前轻轻混合。不要涡旋。在打开前进行快速旋转。等分的小容量，然后闪烁冻结以进行长期存储。避免多个冻结/解冻周期。测定条件：根据ADAR1：RNA TR-FRET分析套件（＃82252）进行测定，具有不同量的ADAR1（E1008Q），FLAG-TAG重组（＃102535）。应用程序：
基于肽的变构抑制剂靶向 TNFR1 ... - DR-NTU
Chih Hung Lo 1,#, * 1 Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, Singapore 308232, Singapore 2 School of Applied Science, Republic Polytechnic, Singapore 738964, Singapore 3 Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia 58893, México 4 School of Chemical Sciences, Meritorious Autonomous University of Puebla (BUAP), University City, Puebla 72570, México # 同等贡献 *通讯作者：Chih Hung Lo，博士 (chihhung.lo@ntu.edu.sg) Víctor M. Baizabal-Aguirre，博士 (victor.baizabal@umich.mx)关键词 TNFR1 信号传导，受体特异性抑制、构象动力学、非竞争性抑制、变构机制、药物发现、肽抑制剂、抗炎摘要肿瘤坏死因子 (TNF) 受体 1 (TNFR1) 在介导 TNF 诱导的信号通路和调节炎症反应中起关键作用。最近的研究表明，TNFR1 活化涉及配体前组装受体二聚体的构象重排，而靶向受体构象动力学是调节 TNFR1 信号的可行策略。在这里，我们结合使用生物物理、生化和细胞分析以及分子动力学模拟来表明抗炎肽 (FKCRRWQWRMKK)（我们称之为 FKC）通过改变受体二聚体的构象状态来变构抑制 TNFR1 活化，而不会阻断受体-配体相互作用或破坏受体二聚化。我们还通过展示该肽抑制 HEK293 细胞中的 TNFR1 信号传导并减轻腹膜内 TNF 注射小鼠的炎症来证明 FKC 的功效。从机制上讲，我们发现 FKC 与 TNFR1 富含半胱氨酸的结构域 (CRD2/3) 结合并扰乱受体激活所需的构象动力学。重要的是，FKC 增加了受体二聚体中 CRD2/3 和 CRD4 的开放频率，并诱导受体胞质区域的构象开放。这会导致抑制构象状态，阻碍下游信号分子的募集。总之，这些数据为靶向 TNFR1 构象活性区域的可行性提供了证据，并为受体特异性抑制 TNFR1 信号传导开辟了新途径。意义
CBA（4-氯-2-（2-氯苯氧甲氧基）乙酰胺）苯甲酸）抑制TMEM206介导的电流，而TMEM206不影响酸诱导的细胞DEA
电导调节剂（CFTR）（Moran，2017）和细胞内钙离子（Ca 2+）激活Anoctamin-1（Ano-1，TMEM16A）（Caputo等，2008）。当前的研究重点是通过增加细胞外质子（H +）浓度激活的Cl-通道。所谓的质子激活外部整流阴离子通道（PAORAC）或酸敏感的外部整流（ASOR）通道在细胞外酸性后介导Cl - 伏布（Lambert and Oberwinkler，Wang等，2007; Wang et al。，2007; Ma等）。tmem206是Paorac/ASOR的分子成分，在2019年已被两个独立研究小组鉴定出来（Ullrich等，2019; Yang等，2019）。此外，最近已经解决了TMEM206的结构：TMEM206形成一个同型通道，每个单体具有两个跨膜跨度的螺旋（Ruan等，2020; Deng等，2021）。根据人类蛋白质地图集，TMEM206显示出几乎普遍存在的mRNA表达，在大脑，肾脏和淋巴组织中最突出的表达（人类蛋白质Atlas，2023）。尚未完全理解其生物学功能。在亚细胞水平上，据报道TMEM206的Cl-电导率可预防内体高酸性（Osei-Owusu等，2021）。此外，已经发现TMEM206有助于大肺炎的收缩，这是一种在免疫和癌细胞中特别重要的内体类型的内体。TMEM206的破坏可降低大细胞体的分辨率，并增加癌细胞的白蛋白依赖性生存率（Zeziulia等，2022）。Wang等。Wang等。除了在囊泡中的丰度外，TMEM206还定位于质膜。在质膜中，据报道TMEM206有助于小鼠，Hela和Hek293细胞的培养神经元细胞中酸诱导的细胞死亡（Wang等，2007; Sato-Numata等，2014; Ullrich等，2019）。 提出TMEM206在诸如缺血性中风和癌症之类的病理中起作用，pH可能会降至6.5以下（Xiong等，2004； Kato等，2013； Thews和Riemann，2019）。 尽管在室温下激活阈值低于pH 5.5，但在37°C时，其转移到〜ph 6.0（Sato-Numata等，2013），因此TMEM206可能在病理生理条件下被激活。 人体内的某些隔室还显示接近TMEM206激活阈值的pH值。 在结肠中，pH值范围从盲肠中的pH值5.7在直肠中缓慢增加到6.7（Fallingborg，1999），因此TMEM206也可能在一般的结肠上皮和结直肠癌中发挥作用，pH值得低于生理条件。 因此，我们想知道TMEM206是否在人类结直肠癌细胞中表达，以及它是否有助于酸诱导的细胞死亡。 为了更好地了解TMEM206对细胞功能的贡献，需要药理学工具。 对通道的药理抑制避免了敲除或敲除的补偿机制。 此外，菲洛莱汀（Wang等，2007）和硫酸妊娠（PS）（Drews等，2014）被报道为PAORAC/ASOR/TMEM206抑制剂，但是，菲律宾是>在质膜中，据报道TMEM206有助于小鼠，Hela和Hek293细胞的培养神经元细胞中酸诱导的细胞死亡（Wang等，2007; Sato-Numata等，2014; Ullrich等，2019）。提出TMEM206在诸如缺血性中风和癌症之类的病理中起作用，pH可能会降至6.5以下（Xiong等，2004； Kato等，2013； Thews和Riemann，2019）。尽管在室温下激活阈值低于pH 5.5，但在37°C时，其转移到〜ph 6.0（Sato-Numata等，2013），因此TMEM206可能在病理生理条件下被激活。人体内的某些隔室还显示接近TMEM206激活阈值的pH值。在结肠中，pH值范围从盲肠中的pH值5.7在直肠中缓慢增加到6.7（Fallingborg，1999），因此TMEM206也可能在一般的结肠上皮和结直肠癌中发挥作用，pH值得低于生理条件。因此，我们想知道TMEM206是否在人类结直肠癌细胞中表达，以及它是否有助于酸诱导的细胞死亡。为了更好地了解TMEM206对细胞功能的贡献，需要药理学工具。对通道的药理抑制避免了敲除或敲除的补偿机制。此外，菲洛莱汀（Wang等，2007）和硫酸妊娠（PS）（Drews等，2014）被报道为PAORAC/ASOR/TMEM206抑制剂，但是，菲律宾是tmem206受到常见的Cl-通道抑制剂DID（4,4' - 二硫代硫代氨基-2,2,2'-省二硫酸）的抑制作用对于TMEM206（Liantonio等，2007； Guinamard等，2013）。
表达胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器的 mRNA 可有效介导体内和体外碱基校正
通过特异性校正治疗遗传病的概念几十年来一直是生物医学领域的焦点。理想的解决方案是提供一种精确的方法来永久修复此类突变而不会引入新的错误。早期的基因编辑尝试涉及使用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR-Cas9 核酸酶在特定位点引入双链断裂，以刺激与外源供体 DNA 模板的同源重组以纠正缺陷。然而，这些技术也会以高频率引入插入/缺失。在这里，我们评估了瞬时 mRNA 治疗引入永久性单碱基编辑的潜力。碱基编辑器通过创新的改良 Cas9 系统提供了在体内纠正单点突变的潜力。胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 使用与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂融合的 Cas9 切口酶。当引导链将胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对导向基因组中的特定位置时，小窗口中的胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对会高效地转化为胸腺嘧啶-腺嘌呤对，且插入/缺失最少。同样，腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 使用实验室进化的与 Cas9 切口酶融合的脱氧腺苷脱氨酶将腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对转化为胞嘧啶-鸟嘌呤对。与基于核酸酶的方法相比，使用碱基编辑器可增加靶向编辑频率，同时大大减少脱靶插入/缺失的形成。与病毒载体和质粒相比，mRNA 具有以下主要优势：1) 降低载体整合风险；2) 能够编辑难以转染的非分裂细胞，因为 mRNA 靶标是细胞质而不是细胞核；3) 可在体内重复给药，这对于病毒载体来说具有挑战性，因为衣壳存在免疫反应；4) 瞬时表达，这对于最大限度提高基因组编辑应用的特异性非常理想。在这项研究中，我们比较了 HEK293 细胞中经过序列优化、化学修饰的 CBE 和 ABE mRNA。Western blot 分析显示，与未修饰的 mRNA 相比，经过 5-甲氧基尿苷修饰、经过序列优化的 mRNA 表达更高。在培养细胞中，mRNA 的编辑频率高于质粒载体。我们展示了使用一个碱基编辑器 mRNA 同时编辑多个位点以及编辑以前无法访问的基因组位点的能力。这些结果证明了碱基编辑技术的深远潜力。最后，我们开发了一种小鼠模型，使用注射到小鼠受精卵中的 BE4max 变体 mRNA，该模型将用于在未来的研究中测试体内 ABE 校正。