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造血干细胞原理和应用
动员的造血干细胞和祖细胞（HSPC）是最广泛使用的血液和恶性疾病患者临床移植的来源。粒细胞刺激因子（G-CSF，也称为纤维状）是诊所中使用的主要动员之一。但是，有一定比例的人被称为“贫穷的动员”，他们对治疗没有反应。因此，生活质量下降，而治疗成本大大增加。G-CSF的机制仍然很了解。在这里，我们首次显示G-CSF通过中性粒细胞激活增加骨髓乳酸水平，这对于成功动员至关重要。否则，中性粒细胞耗竭会降低BM乳酸水平并损害HSPC动员。第一次，我们展示了乳酸作为HSPC动员中主要参与者的新作用，然后可以将其视为检测甚至纠正较差的动员器的标记。
利用 CRISPR-Cas9 基因编辑弗里德赖希共济失调患者的造血干细胞
弗里德赖希共济失调 (FRDA) 是一种常染色体隐性神经退行性疾病，由 frataxin (FXN) 基因内含子 1 中的 GAA 重复扩增引起，导致线粒体铁结合蛋白 frataxin 的表达显著降低。我们之前报告说，同基因造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 移植可防止 FRDA 小鼠模型 YG8R 中的神经退行性。我们表明，挽救机制是由功能性 frataxin 从 HSPC 衍生的小胶质细胞/巨噬细胞转移到神经元/肌细胞所介导的。在本研究中，我们报告了使用 CRISPR-Cas9 系统进行 FRDA 自体 HSPC 移植的第一步。我们首次鉴定出一对 CRISPR RNA（crRNA），它们可有效消除人类 FRDA 淋巴母细胞中的 GAA 扩增，恢复 frataxin 表达的非病理水平，并使线粒体活动正常化。我们还优化了从健康和 FRDA 患者外周血中分离的 HSPC 中的基因编辑方法，并证明基因编辑细胞在体外和体内造血正常。该过程不会诱发细胞毒性作用或重大脱靶事件，但在基因编辑细胞中观察到 p53 介导的细胞增殖延迟。这项研究为将基因校正的 HSPC 自体移植用于 FRDA 的临床转化奠定了基础。
SARS-COV-2假病毒失调并诱导造血干细胞和祖细胞炎症
严重的急性呼吸综合症冠状病毒2（SARS-COV-2）感染主要影响呼吸系统，但可能引起血液学改变，例如贫血，淋巴细胞减少和血小板减少症。先前的研究报告说，SARS-COV-2有效地感染了造血茎和祖细胞（HSPC）。但是，尚未描述对造血和免疫重建的后续影响。在这里，我们评估了使用SARS-COV-2 Omicron变体假病毒（PSV）的脐带血液衍生的HSPC感染的病理影响。OMICRON PSV感染的HSPC的转录组分析揭示了涉及炎症，衰老和NLRP3炎症的基因的上调，这表明插入的潜在触发触发器。OMICROR PSV感染的HSPC呈现的多重祖细胞数量减少（粒细胞 - 红细胞 - 巨噬细胞 - 巨噬细胞 - 巨核细胞群形成单位）ex vivo和vivo和重生的造血干细胞（Ki-67--hcd34 + s） γ空小鼠模型（Omicron小鼠）。此外，Omicron PSV感染诱导了HSPC的髓样偏差。用抗病毒剂纳米摄影烯氧化物治疗，部分缓解了体外和体内的髓样偏置和炎症表型。这些发现提供了有关SARS-COV-2感染的造血和免疫作用异常的见解，并突出了潜在的治疗干预措施。
利用 CRISPR-Cas9 基因编辑弗里德赖希共济失调患者的造血干细胞
弗里德赖希共济失调 (FRDA) 是一种常染色体隐性神经退行性疾病，由 frataxin (FXN) 基因内含子 1 中的 GAA 重复扩增引起，导致线粒体铁结合蛋白 frataxin 的表达显著降低。我们之前报告说，同基因造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 移植可防止 FRDA 小鼠模型 YG8R 中的神经退行性。我们表明，挽救机制是由功能性 frataxin 从 HSPC 衍生的小胶质细胞/巨噬细胞转移到神经元/肌细胞所介导的。在本研究中，我们报告了使用 CRISPR-Cas9 系统进行 FRDA 自体 HSPC 移植的第一步。我们首次鉴定出一对 CRISPR RNA（crRNA），它们可有效消除人类 FRDA 淋巴母细胞中的 GAA 扩增，恢复 frataxin 表达的非病理水平，并使线粒体活动正常化。我们还优化了从健康和 FRDA 患者外周血中分离的 HSPC 中的基因编辑方法，并证明基因编辑细胞在体外和体内造血正常。该过程不会诱发细胞毒性作用或重大脱靶事件，但在基因编辑细胞中观察到 p53 介导的细胞增殖延迟。这项研究为将基因校正的 HSPC 自体移植用于 FRDA 的临床转化奠定了基础。
间充质基质细胞改善 CRISPR-Cas9 基因编辑的人类 HSPC 的移植结果
间充质基质细胞 (MSC) 已用于体外支持造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 扩增和体内促进 HSPC 植入。基于这些研究，我们开发了一种基于 MSC 的共培养系统，以优化成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 基因编辑 (GE) 人类 HSPC 的移植结果。我们表明，骨髓 (BM)-MSC 产生多种造血支持和抗炎因子，能够缓解增殖停滞并减轻 GE-HSPC 中激活的凋亡和炎症程序，从而提高其体外扩增和克隆形成潜力。使用 BM-MSC 可实现更佳的人体植入，并增加 GE-HSPC 的克隆产量，从而促进移植小鼠外周血的早期血液重建。总之，我们的工作为 BM-MSC 的新临床应用提供了生物学基础，以促进 GE-HSPC 的植入并改善其移植结果。
工程干细胞抗体配对逃避1（...
我们的主要抗 CD117 mAb mAb-7 与未编辑的 HSPC 具有高亲和力，但与 CD117 编辑的细胞不结合（图 4）。mAb-7 与 CD117 结合可阻断 SCF-CD117 相互作用（图 4），从而选择性抑制未编辑 HSPC 的存活（图 5、6）。体外用 mAb-7 处理 HSPC 导致未编辑 HSPC 活力降低 85% 以上，而 CD117 编辑的细胞不受影响（图 5、6）。由于 CD117 信号传导与肥大细胞脱颗粒有关，我们评估了天然和 Fc 工程化版本的 mAb-7 对体外培养分化的肥大细胞的影响。Fc 工程化版本的 mAb-7 在体外不会导致任何程度的肥大细胞脱颗粒（图 6）。我们在体外比较了我们修饰的 CD117 与野生型 CD117 的磷酸化（图 7）。我们的 CD117 变体蛋白正常与 SCF 结合，在 SCF 结合后经历了相似水平的磷酸化（与 WT 蛋白相比）。我们在 HSPC 中实现了约 80% 的双等位基因 CD117 编辑和近乎完全的 HBG1/2 基因座编辑（图 8）。在异种移植研究中，我们观察到 CD117 编辑的 HSPC 能够在免疫功能低下的小鼠中进行长期多谱系造血植入（图 9）。重要的是，mAb-7 治疗导致仅使用未编辑的人类 CD34+ 细胞人源化的小鼠的人类嵌合体以及骨髓 CD34+ 细胞频率显着降低。有趣的是，在接受编辑：未编辑混合物的小鼠中，mAb-7 导致 CD117 编辑细胞在整个骨髓和 CD34+ 细胞区室中富集，这由这些区室中的高编辑水平表明（图 10）。
CRISPR-Cas9 介导的造血干细胞和祖细胞 ELANE 突变校正可治疗严重先天性中性粒细胞减少症
严重先天性中性粒细胞减少症 (SCN) 是一种单基因疾病。SCN 患者容易发生复发性危及生命的感染。SCN 的主要原因是 ELANE 基因的常染色体显性突变导致中性粒细胞分化受阻。在本研究中，我们使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和腺相关病毒 (AAV)6 作为供体模板递送系统来修复 SCN 患者来源的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中的 ELANE L172P 突变。我们使用了专门针对突变等位基因的单向导 RNA (sgRNA) 和针对 ELANE 外显子 4 的 sgRNA。使用后者 sgRNA，原则上可以修复 34% 的已知 ELANE 突变。我们在 SCN 患者来源的 HSPC 中实现了高达 40%（使用 sg ELANE -ex4）和 56%（使用 sg ELANE - L172P）的基因校正效率。在将 HSPC 移植到人源化小鼠中后，基因修复在体外和体内恢复了中性粒细胞分化。成熟的编辑中性粒细胞表达正常的弹性蛋白酶水平，并在功能测定中表现正常。因此，我们为使用 CRISPR-Cas9 纠正患者来源的 HSPC 中的 ELANE 突变提供了原理证明，这可能转化为 SCN 的基因治疗。
通过 CRISPR 基因组编辑在人类 HSPC 中建立多重 HDR 疾病和 SCID 校正模型
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。
RPS19 编辑的 Diamond-Blackfan 贫血模型...
戴蒙德-布莱克凡贫血 (DBA) 是一种遗传性血液疾病，由核糖体蛋白 (RP) 基因（最常见的是 RPS19）的杂合功能丧失突变引起。DBA 的标志性特征是婴儿发生的发育不全性贫血，但一些年龄较大的患者会出现骨髓细胞减少症和多系血细胞减少症。DBA 中贫血的机制尚不完全清楚，对于生命后期发生的全血细胞减少症的了解就更少了，部分原因是患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 难以获得，而目前的实验模型并不理想。我们通过使用 CRISPR/Cas9 编辑健康人类供体 CD34 + HSPC 来创建 RPS19 单倍体不足，从而模拟了 DBA。体外分化显示髓系生成正常和红细胞生成受损，如在 DBA 中观察到的那样。移植到免疫缺陷小鼠体内后，RPS19 +/− HSPC 的骨髓再生能力显著降低，表明造血干细胞 (HSC) 受损。RPS19 单倍体不足导致的红细胞和 HSC 缺陷可通过用表达 RPS19 的慢病毒载体转导或通过 Cas9 破坏 TP53 得到部分纠正。我们的研究结果基于对原代人类 HSPC 的基因组编辑，定义了一种可处理、生物学相关的 DBA 实验模型，并确定了一种模拟 DBA 全造血缺陷的相关 HSC 缺陷。