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标准化的术语和PACBIO HIFI测序和RAAV基因治疗载体分析的报告
尽管重组腺相关病毒（RAAV）是基因疗法的主要平台，但缺乏标准化的计算分析方法和通过长阅读测序评估每个帽子的内容的报告。PACBIO高度准确的长阅读HIFI测序可以对AAV基因组进行全面表征，但需要生物信息学专业知识来分析，解释和比较结果。为了满足这一需求并提高对功能性病毒有效载荷的理解，我们的工作组建立了标准化的命名法，并报告了RAAV矢量的长阅读测序数据。工作组建议涵盖与矢量纯度（全长与零散基因组）和污染物（宿主DNA，质粒DNA）鉴定有关的关键质量属性（CQA）。通过推荐的协议，我们对从头制造的数据分析揭示了全部和部分填充的衣壳的特异性以及部分/截断的载体物种的高分辨率表征。最后，我们提供了实施此
Sanger 生命之树 HMW DNA 碎片化：用于 PacBio HiFi 的 Diagenode Megaruptor®3
本方案描述了使用 Diagenode Megaruptor®3 从 MagAttract v.1、Plant MagAttract v.1 或 Plant MagAttract v.2 Sanger Tree of Life HMW DNA 提取方案中对 HMW DNA 进行片段化。该过程对于从生命之树计划涵盖的所有分类群中提取 DNA 非常有效，DNA 被剪切成平均 12-20 kb 大小的片段。然而，具有挑战性的样本包括那些浓度高或粘度大的样本，以及 DNA 提取后含有污染物或杂质的样本。该方案的输出是剪切的 DNA，可以使用手动或自动 SPRI 方案将其用于碎片 DNA 清理。该协议已更新为 Sanger Tree of Life HMW DNA Fragmentation：Diagenode Megaruptor® 3 for LI PacBio，以处理由 Sanger Tree of Life HMW DNA Extraction：Automated MagAttract v.2、Automated Plant MagAttract v.3 和 Automated Plant MagAttract v.4 协议产生的样本。
应用注释 - puretarget重复扩展面板和HIFI测序的全面基因分型
自定义Puretarget面板没有PACBIO正式支持。用户必须设计和订购其指南RNA并相应地优化其自定义面板。PACBIO可以提供有关指南RNA设计软件和优化自定义面板的策略的有限指导。我们建议在添加新的指南RNA或测试一组自定义指南之前，请首先使用支持的样本类型在Puretarget重复扩展面板上进行成功。添加少量重复扩展目标是相对较低的风险，因为片段的大小与套件（4-5 kb）中提供的面板相似。已显示出多达5对指南的成功，以实现其他重复扩展目标。SMRT链接PuretArget重复扩展分析或带有TRGT的命令行分析可以与包括新坐标的更新目标床文件一起使用。
利用 PacBio HiFi 测序进行大规模微生物基因组学研究
仅供研究使用。不得用于诊断程序。© 2024 Pacific Biosciences of California, Inc.（“PacBio”）。保留所有权利。本文件中的信息如有更改，恕不另行通知。PacBio 对本文件中的任何错误或遗漏不承担任何责任。某些通知、条款、条件和/或使用限制可能与您使用 PacBio 产品和/或第三方产品有关。请参阅适用的 PacBio 销售条款和条件以及 pacb.com/license 上的适用许可条款。Pacific Biosciences、PacBio 徽标、PacBio、Circulomics、Omniome、SMRT、SMRTbell、Iso-Seq、Sequel、Nanobind、SBB、Revio、Onso、Apton、Kinnex、PureTarget、SPRQ 和 Vega 是 PacBio 的商标。
应用简介-使用 HiFi 进行宏基因组测序-...
1. 应用说明 – Kinnex 16S rRNA 试剂盒用于全长 16S 测序 2. Johnson, JS 等人 (2019) 评估 16S rRNA 基因测序在物种和菌株水平微生物组分析中的应用。《自然通讯》。10(1)，5029。 3. 程序和清单 – 使用 HiFi plex 制备试剂盒 96 制备多重全基因组和扩增子文库 4. 程序和清单 – 使用 HiFi 制备试剂盒 96 制备全基因组文库 5. Gehrig, J. 等人 (2022) 找到合适的选择：评估短读和长读测序方法以最大限度提高临床微生物组数据的效用。《微生物基因组学》，8(3)，10.1099/mgen.0.000794。 6. Portik, DM 等人(2024) 使用长读组装、分箱和合并方法从人类肠道微生物群中高度准确地组装宏基因组。bioRxiv。doi：https://doi.org/10.1101/2024.05.10.593587 7. 概述 – HiFi 应用选项和测序建议。8. 程序和清单 – 使用条形码引物扩增细菌全长 16S 基因。9. 程序和清单 – 从 16S rRNA 扩增子制备 Kinnex 文库
技术说明 - 使用 DNA Genotek Oragene 设备收集并使用 Nanobind 试剂盒提取的唾液 DNA 样本的 HiFi 测序性能
采集了 30 位捐献者的唾液样本，其中 90% 的分析前 DNA 质量 >2 µg。从 27 个样本中提取了 HMW DNA，其中 93% 的产量 >500 ng。提取后，使用 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒对 DNA 进行定量，并使用 Femto Pulse 系统（安捷伦科技公司）进行表征。使用 SMRTbell ® 制备试剂盒 3.0 为部分样本制备 HiFi 文库，并使用 SPRQ™ 化学方法在 Revio 系统上进行测序。每个样本都在一个 Revio SMRT 测序池上进行测序。表 1 总结了五个代表性样本的测序数据。这些样本产生了 4.7 到 15.9 µg 的 HMW DNA。HiFi 测序产量为 119 到 133 Gb 的 HiFi 数据，每个基因组的覆盖率为 27 到 40 倍，足以进行全面的 WGS 变异检测。 75% 到 95% 的读数映射到人类参考基因组 (GRCh38)。
使用 HiFi 制备试剂盒 96 制备全基因组文库
HiFi 制备试剂盒 96 和工作流程专为 NGS 液体处理自动化而设计。因此，该协议旨在描述 SRE、剪切、文库制备酶促反应和珠子清理，以指导自动化方法开发，或在某些情况下进行手动制备。由于自动化仪器之间存在差异，可能需要进行本文未描述的修改，以使协议适应您的特定仪器。请访问 WGS 页面或联系您当地的支持团队，获取具有 PacBio 合格方法的仪器列表。该协议是使用 Hamilton NGS STAR MOA 系统开发的。
动植物科学在HIFI测序
所有样品吞吐量均为使用1个SMRT Cymist的VEGA系统的VEGA系统的估计值，使用1 SMRT细胞的SPRQ化学。覆盖范围可能会根据样本质量，图书馆质量和片段长度而有所不同。当前可用的SMRTBELL®适配器索引板96A-96D总共包含384个SMRTBELL条形码适配器。微生物从头组装假定的微生物为2 GB的总基因组大小为每个样品30倍。单细胞转录组学在Revio系统上的每个库中≥8000万次读取，在VEGA系统上的每个库中约有500-6亿个读取。全长RNA测序假设Revio Sprq的总读数为60m，而Vega的30m读取，无论有何plexity。Amplicon测序假设电影时间为1-5 kb的12小时电影时间，24小时的电影时间为5+ kb，每个样本> 50倍。目标富集假设每个样品> 50倍。
使用 GeneArt Gibson Assembly HiFi 克隆试剂盒进行定点诱变
仅供研究使用。不可用于诊断程序。© 2024 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。除非另有说明，所有商标均为 Thermo Fisher Scientific 及其子公司的财产。Amersham 和 Typhoon 是 Cytiva 的商标。SnapGene 是 GSL Biotech LLC 的商标。Gibson Assembly 是 Telesis Bio, Inc. 的商标，经许可和授权使用。APN-9114086 1024
nebuilder hifi dna组件bifold
使用Nebuilder HIFI HIFI DNA组装大师组合（NEB＃E2621），Geneart Gibson组装混合物（Thermo Fisher＃A46627）和Fifusion Snap组装组合（TAKARBLEBLBLEBLEBLBLEBLEBLEM）（TAKARE MIX）（TAKARA）（TAKARE MIX）（takARe Mix77），使用NEBUILDER HIFI HIFI HIFI GASSINBLY MIX（NEB＃E2621），使用线性化载体（30 ng CRISPR核酸酶报告基因DNA）组装。在50°C下进行60分钟或15分钟进行组装反应。2μL组装的混合物被转化为NEB 5-Alpha胜任的大肠杆菌NEB＃C2987）。通过PCR进一步筛选20个菌落，以确认插入物的存在。超过95％的从Nebuilder Hifi和Geneart Gibson组装反应中测试的菌落中包含适当的插入物，尽管Geneart Gibson组装产生的菌落较少。融合式快照没有产生任何成功的菌落。nebuilder Hifi DNA组装主混合均优于Geneart Gibson组装和融合式快照组件。