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用5-碱基HIFI测序测量DNA甲基化
仅研究使用。不适用于诊断程序。©2023加利福尼亚州的太平洋生物科学（“ PACBIO”）。保留所有权利。此文档中的信息如有更改，恕不另行通知。PACBIO对本文档中的任何错误或遗漏不承担任何责任。某些通知，条款，条件和/或使用限制可能与您使用PACBIO产品和/或第三方产品有关。请参阅适用的PACBIO销售条款和条件以及PACB.com/license的适用许可条款。Pacific Biosciences，PACBIO徽标，PACBIO，Circulomics，Omniome，Smrt，Smrtbell，Iso-Seq，Seqel，Seqel，Nanobind，SBB，Revio，Revio，Onso，Apton，Apton和Kinnex是PacBio的商标。
动植物科学在HIFI测序
所有样品吞吐量均为使用1个SMRT Cymist的VEGA系统的VEGA系统的估计值，使用1 SMRT细胞的SPRQ化学。覆盖范围可能会根据样本质量，图书馆质量和片段长度而有所不同。当前可用的SMRTBELL®适配器索引板96A-96D总共包含384个SMRTBELL条形码适配器。微生物从头组装假定的微生物为2 GB的总基因组大小为每个样品30倍。单细胞转录组学在Revio系统上的每个库中≥8000万次读取，在VEGA系统上的每个库中约有500-6亿个读取。全长RNA测序假设Revio Sprq的总读数为60m，而Vega的30m读取，无论有何plexity。Amplicon测序假设电影时间为1-5 kb的12小时电影时间，24小时的电影时间为5+ kb，每个样本> 50倍。目标富集假设每个样品> 50倍。
场效应晶体管第 11 部分 - CMOS - Pearl HiFi
图 1 显示了 n 沟道结型场效应晶体管 (FET) 的原理图结构。如果在沟道上施加电压，使漏极相对于源极为正，如图 Ib 所示，电子会通过沟道从源极流向漏极，从而产生漏极电流。漏极电流的大小由沟道的电导率和漏极-源极电压决定。当在栅极上施加负电压时，栅极将反向偏置。栅极和沟道之间的 pn 结周围会形成耗尽层，如图 1c 所示。因此，如果漏极-源极电压为恒定值，则漏极电流会因栅极-源极电压而变化。如果栅极电压足够负，则耗尽层将延伸到整个沟道，漏极电流会变得非常小；然后沟道被称为“夹断”。因此，JFET 被称为耗尽或“常开”器件。
真核ITS和rRNA扩增子的全长HIFI测序
与简短的读数相比，覆盖范围仅限于ITS1或ITS2区域，HIFI读取的读数涵盖了全真菌其区域的全长。这包含800 bp，如果包括18s和/或28S基因以跨越操纵子，则可以提供约5 kb的扩增子。以及更保守的rRNA基因，这些区域允许在物种水平上降低序列相似性和更高分辨率的分类信息（Tedersoo等，2018； Tedersoo等人，2021年，图2）。除了产生更高的分类价值外，HIFI全长扩增子测序的成本与短阅读的部分扩增子测序相当。在本申请注释中，我们提供了从复杂社区DNA样品中扩增全长真核ITS和rRNA区域的一般指导。
Sanger 生命之树 HMW DNA 碎片化：用于 PacBio HiFi 的 Diagenode Megaruptor®3
本方案描述了使用 Diagenode Megaruptor®3 从 MagAttract v.1、Plant MagAttract v.1 或 Plant MagAttract v.2 Sanger Tree of Life HMW DNA 提取方案中对 HMW DNA 进行片段化。该过程对于从生命之树计划涵盖的所有分类群中提取 DNA 非常有效，DNA 被剪切成平均 12-20 kb 大小的片段。然而，具有挑战性的样本包括那些浓度高或粘度大的样本，以及 DNA 提取后含有污染物或杂质的样本。该方案的输出是剪切的 DNA，可以使用手动或自动 SPRI 方案将其用于碎片 DNA 清理。该协议已更新为 Sanger Tree of Life HMW DNA Fragmentation：Diagenode Megaruptor® 3 for LI PacBio，以处理由 Sanger Tree of Life HMW DNA Extraction：Automated MagAttract v.2、Automated Plant MagAttract v.3 和 Automated Plant MagAttract v.4 协议产生的样本。
IDT Alt-R Sp HiFi Cas9 核酸酶 V3 (CRS-10083-FL 03/19)
图 1. Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 促进近野生型靶向编辑效力并显著减少脱靶位点编辑。RNP 复合物由 Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3 或 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 与靶向 EMX1 基因的 Alt-R crRNA:tracrRNA 复合物结合形成。RNP 复合物 (4 µM) 通过 Nucleofection™ 方法 (Lonza) 递送到 HEK-293 细胞中。通过下一代测序 (rhAmpSeq 扩增子测序，IDT) 测量了靶位点和 9 个已知脱靶位点处的插入/缺失形成 (在 y 轴上以对数标度表示)。
使用 HiFi 制备试剂盒 96 制备全基因组文库
HiFi 制备试剂盒 96 和工作流程专为 NGS 液体处理自动化而设计。因此，该协议旨在描述 SRE、剪切、文库制备酶促反应和珠子清理，以指导自动化方法开发，或在某些情况下进行手动制备。由于自动化仪器之间存在差异，可能需要进行本文未描述的修改，以使协议适应您的特定仪器。请访问 WGS 页面或联系您当地的支持团队，获取具有 PacBio 合格方法的仪器列表。该协议是使用 Hamilton NGS STAR MOA 系统开发的。
使用 GeneArt Gibson Assembly HiFi 克隆试剂盒进行定点诱变
仅供研究使用。不可用于诊断程序。© 2024 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。除非另有说明，所有商标均为 Thermo Fisher Scientific 及其子公司的财产。Amersham 和 Typhoon 是 Cytiva 的商标。SnapGene 是 GSL Biotech LLC 的商标。Gibson Assembly 是 Telesis Bio, Inc. 的商标，经许可和授权使用。APN-9114086 1024
应用注释 - puretarget重复扩展面板和HIFI测序的全面基因分型
自定义Puretarget面板没有PACBIO正式支持。用户必须设计和订购其指南RNA并相应地优化其自定义面板。PACBIO可以提供有关指南RNA设计软件和优化自定义面板的策略的有限指导。我们建议在添加新的指南RNA或测试一组自定义指南之前，请首先使用支持的样本类型在Puretarget重复扩展面板上进行成功。添加少量重复扩展目标是相对较低的风险，因为片段的大小与套件（4-5 kb）中提供的面板相似。已显示出多达5对指南的成功，以实现其他重复扩展目标。SMRT链接PuretArget重复扩展分析或带有TRGT的命令行分析可以与包括新坐标的更新目标床文件一起使用。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。