图3。凝胶电泳图像捕获超螺旋的,未消除的PUC19(泳道B);线性PUC19用Hindiii(泳道C)消化; PUC19用苯酚(150 ppm)升高,并消化了印度菌(D); PUC19用EDTA(20毫米)和Hindiii消化(Lane E)升高。在1.2%的琼脂糖凝胶上运行。梯子在车道A中显示为基座对。
电泳:1%琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液 上样DNA量:uL/泳道大小 marker:Lambda/HindIII(200ng/泳道) marker(Lambda/HindIII,NEB#3012S)(uL)
图2:与替代性DSB测序技术相比,诱导seq表现出无与伦比的灵敏度和动态范围。(a)诱导seq同时检测高度复发的诱导DSB和低级内源性DSB,并以高分辨率。基因组浏览器视图(IgV)诱导seq读取映射到HEK293T细胞的10MB部分,随后与限制性核酸内核酸内切酶Hindiii进行原位裂解。(顶部面板)高度复发性酶诱导的断裂表示在低分辨率(10MB,0-1000读物)时的绝大多数读数。(底部面板)高分辨率视图(粉红色的亮点,500kb,0-20读取)显示出未处理样品中存在的低水平的单源性断裂,以及在复发性印度诱导的突破(绿色亮点)中。(b)诱导seq读取的映射在Hindiii目标位点显示了断裂两侧的单核苷酸断裂映射的精度。(c)对经过治疗和对照样品的每个细胞测量的断裂定量。诱导seq在样品之间的3个数量级上定量检测到每个细胞的断裂。(d和e)通过酶Hindiii和ecorv检测体外裂解限制位点时诱导seq和dsbapture之间的比较。(d)使用诱导seq映射到测序和对齐基因组的读取和对齐基因组的比例更大。(e)使用少800倍的细胞,诱导seq鉴定了与DSBCAPTURE确定的ECORV(93.7%)相似的Hindiii限制位点(92.7%)。(f)使用诱导seq的诱导DSB检测的动态范围。除了在印度内目标序列(AAGCTT)上鉴定出的断裂外,还确定了多个1BP和2BP不匹配靶向位点。诱导seq测得的诱导的休息事件,跨越了8个数量级,从在印度内靶标地点确定的约1.5亿次断裂到最少频繁的脱离目标的5个断裂。(g)在检测ASISI诱导的活细胞中诱导的疾病,DSBCAPTURE和BLISS之间的比较。将测序的读取数(顶部面板)与每个实验(底部面板)识别的ASISI位点的数量进行了比较。诱导seq使用比DSBCAPTUE少的40倍读数检测到最大数量的ASISI位点,而读取的读数比Bliss少23倍。
功能活性(粘性终端连接):20μl含有0.5 µL快速T4 DNA连接酶,12μgHindiii消化的lambda DNA和1x T4 DNA连接酶在37°C下孵育37°C,过夜,由Agarose gelorophoresis确定的片段,在> 95%的片段中,> 95%的片段。重新消化的连接产物,50μl反应,其中含有6μg连接的片段,40个单位Hindiii和1x的Nebuffer 2在37°C下孵育2小时,导致未检测到的未检测到的未发现的片段,因为琼脂糖凝胶电基果实确定。
车道M:Lambda DNA/Hindiii标记;道1:人骨髓;泳道2:人类血;泳道3:老鼠脾脏;泳道4:鼠标心;泳道5:小鼠肝;泳道6:HeLa细胞;泳道7:E.COLI;泳道8:DH5 A细胞。
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产品名称:PspXI 产品编号:R0656S 浓度:5,000 U/ml 单位定义:一个单位定义为在总反应体积为 50 µl 的情况下,在 37°C 下 1 小时内消化 1 µg Lambda DNA(HindIII 消化物)所需的酶量。 包装批号:10215557 有效期:10/2025 储存温度:-20°C 储存条件:300 mM NaCl、10 mM Tris-HCl(pH 7.4)、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、50% 甘油、500 µg/ml BSA 规格版本:PS-R0656S/L v1.0
产品名称:XhoI 产品编号:R0146S 浓度:20,000 U/ml 单位定义:一个单位定义为在 37°C 下 1 小时内消化 rCutSmart 缓冲液中的 1 µg Lambda DNA(HindIII 消化)片段所需的酶量,总反应体积为 50 µl。 包装批号:10269860 有效期:05/2026 储存温度:-20°C 储存条件:10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、50% 甘油、200 µg/ml rAlbumin(pH 7.4 @ 25°C) 规格版本:PS-R0146S/L/E v3.0