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使用未修饰的 PCR 产物进行片段分析，采用高通量方法鉴定 CRISPR 产生的斑马鱼突变体
多年来，通过 CRISPR 技术，斑马鱼、果蝇和秀丽隐杆线虫的定向诱变技术得到了显著改进。通过在体内诱导小的靶向突变，CRISPR 使研究人员能够有效地检查细胞通路。虽然这些突变通常是随机插入或缺失 (indel)，但如果 CRISPR 组件设计得当，它们通常会导致靶基因的功能性破坏。但是，当前用于识别 CRISPR 生成的插入/缺失的协议通常需要大量劳动力、耗时或成本高昂。在这里，我们描述了一种直接、高通量的方法，用于通过使用片段分析仪平台来识别突变的存在，该平台允许通过高分辨率毛细管凝胶电泳进行 DNA 片段大小测定。按照该协议，可以快速可靠地识别小的插入/缺失（少至 2 个碱基对），从而可以对新生成的或稳定的突变系进行大规模基因分型。
德国协会的第68届年会
- LibraryPrep o Starting material o Overview of different techniques o Panel design (commercial and custom panels), LibraryPrep - NGS o Requirements o Sequencing methods - Data analysis o Requirements o Bcl2Fastqs, fastq.file o Mapping sequences to the reference genome: bam.files o Quality parameters: fastQC, demultiplexing Stats, read counts, coverage, read distribution, deduplication rate o SNP and small InDels calling, copy number analysis, LOH analysis, fusion analysis - Data interpretation, hands on part: o AMP / ASCO / CAP guideline (PMID: 27993330) o Mutations, small InDels → IGV, OncoKG, InterVar, QCI: hands on interpretation o Copy number variations / LOH o RNA-Fusion → Cosmic Fusion curation - Wrap up: Learning content summary, Quiz
德国协会的第68届年会
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MRIADMYCHOICE®CDX加上技术规格...
•用于体外诊断•仅用于专业用途•仅用于处方使用•MyChoice®CDXPlus测定法可以识别肿瘤中的种系和躯体变体，但没有区分两者。•等位基因频率的变化低于已建立的检测极限。•跨越长插入和缺失（Indels）或重排的DNA片段的杂交效率降低可能导致最终测序文库中突变DNA分子的代表性不足。这将导致观察到的序列读取频率跨越突变的频率。•Indels> 25 bp的长度可以通过MyChoice®CDXPlus分析检测到。但是，检测到任何特定indel的能力可能会受到突变的位置和性质，局部序列上下文，DNA质量以及所提供的样品中非肿瘤DNA含量的影响。•MyChoice®CDXPlus分析已设计为检测基因组重排，包括涉及启动子和分析基因的编码外显子的大重排（LRS）；但是，
德国协会的第68届年会
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标题：肠道菌群脑瘤诱导的肠道菌群失调调节1
体细胞变体检测是癌症基因组学分析的组成部分。尽管大多数方法都集中在短阅读测序上，但长阅读技术现在在重复映射和变体相位方面具有潜在的优势。我们提出了一种深度学习方法，一种深度学习方法，用于从短读和长阅读数据中检测体细胞SNV，插入和缺失（indels），具有用于全基因组和外显子组测序的模式，并且能够以肿瘤正常，唯一的肿瘤正常，ffpe pppe的样本进行运行。为了帮助解决公共可用培训的缺乏和基准测试数据以进行体细胞变体检测，我们生成并公开提供了一个与Illumina，Pacbio Hifi和Oxford Nanopore Technologies的五个匹配的肿瘤正常细胞线对的数据集，以及基准的变体。在样本和技术（短读和长阅读）中，深度态度始终优于现有呼叫者，特别是对于Indels而言。
用BATH对蛋白质编码DNA的敏感且耐误差的注释
我们提出了Bath，这是一种基于该DNA与蛋白质序列数据库的直接比对或对蛋白质序列的数据库的直接比对或蛋白质序列或profe file file file隐藏的马尔可夫模型（PHMMS）的高度敏感注释的工具。BATH建立在HMMER3代码库的顶部，并通过提供直接的输入接口和易于解释的输出来简化基于PHMM的注释的注释工作。BATH还引入了新型的Frameshift感知算法，以检测诱导核苷酸插入和缺失（Indels）。BATH匹配HM-MER3对于包含误差的序列注释的准确性，并产生与所有经过测试的工具相比，用于含有核苷酸indels的序列的所有测试工具。这些结果表明，当需要高注释灵敏度时，应使用浴缸，尤其是当预期的移码误差被期望中断蛋白质编码区域时，与长期读取的数据和假基因的背景下一样。
使用基于CRISPR的设计器外显子插入
使用基因编辑技术将大型DNA片段的精确精确插入到体细胞中，以标记或修饰内源性蛋白质仍然具有挑战性。由非同源末端连接途径产生的非特异性插入/删除（Indels）使过程容易出错。此外，插入物不容易移动。在这里，我们描述了一种称为Crisp R介导的E Xon（Crispie）的方法，该方法可以使用基于CRISPR/CAS9的编辑精确，可逆地标记内源性蛋白质。crispie插入了设计器供体模块，该模块由编码内含子序列的蛋白质序列的外显子组成，并将其内含子序列置于目标基因的内含子位置。插入连接处的Indels将被剪接，而mRNA几乎没有错误。我们使用Crispie在体内在哺乳动物神经元中荧光标记内源性蛋白，并以前未能达到的效率。我们证明了此方法广泛适用，并且以后可以轻易删除插入物。Crispie允许具有高保真，效率和灵活性的蛋白质序列插入。
Duoseq的临床实验室绩效特征，A ...
目标2：使用475个基因面板评估了分析性能，该基因面板包括在已知等位基因频率下具有广泛临床重要变体（SNV，INDELS和SVS）的FFPE病例中大量已知基因驱动因素。通过对FFPE细胞系颗粒的稀释研究，我们确定SNV的LOD为≥5％突变等位基因频率（MAF），Indels的MAF≥10％，SVS的肿瘤纯度≥20％（表1）。duoseq在跑步和运算符精确研究中均达到了> 98％的可重复性（数据未显示）。内部和LAB间的可重复性，并在可比等位基因频率下对事件进行了高度可重复的检测（表2中的数据）。 这些结果表明，杜塞克能够在实验室之间进行均匀的肿瘤分析。内部和LAB间的可重复性，并在可比等位基因频率下对事件进行了高度可重复的检测（表2中的数据）。这些结果表明，杜塞克能够在实验室之间进行均匀的肿瘤分析。
通过潮汐和TIDE对CRISPR基因组编辑的快速定量评估
当前的基因组编辑工具使许多物种中选定的DNA序列的靶向诱变。但是，通过基因组编辑方法引入突变的效率和类型在很大程度上取决于目标位点。因此，很难预测编辑操作的结果。因此，量化突变频率的快速测定对于正确评估基因组编辑作用至关重要。我们开发了两种快速，具有成本效益且容易适用的方法：（1）潮汐，可以准确识别和量化插入和删除（indels），这些插入和删除（indels）在引入双链断裂后出现的（dsbs）； （2）Tider，适用于模板介导的编辑事件，包括点突变。这两种方法仅需要一组PCR反应和标准的Sanger测序运行。通过潮汐或TIDE算法分析序列轨迹（可在https://tide.nki.nl或https://deskgen.com上获得）。例程很容易，快速，并且提供了比当前基于酶的测定更详细的信息。潮汐和TIDE加速基于DSB的基因组编辑策略的测试和设计。