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ipscs白皮书碎片
目前肿瘤细胞治疗方法包括自体或同种异体细胞起始材料，以此为原料设计出针对肿瘤的治疗细胞产品。同种异体细胞可以进一步分解为供体或 iPSC 衍生的起始材料。供体衍生的起始材料通常来自健康供体的循环或脐带血，随后收获治疗细胞类型（例如，自然杀伤细胞或 NK 细胞）并在复杂的细胞培养过程中扩增，该过程通常包括多种细胞因子、生长因子、基因工程和饲养细胞，以产生许多细胞剂量。或者，基于 iPSC 的方法通常需要逐步实施多种复杂的细胞培养条件，以驱动细胞通过必要的祖细胞阶段，最终获得预期的免疫效应细胞类型，通常是 NK 细胞。这种方法在产生必要的中间祖细胞方面效率低下，导致 NK 细胞的初始产量低，然后需要饲养细胞驱动的扩增。这种由饲养细胞驱动的扩增会显著降低最终细胞治疗产品的增殖能力，因此需要大量（约 10 亿个细胞）且重复给药，再加上反复的淋巴细胞清除化疗，才能实现必要的植入和暴露，从而产生抗肿瘤效果。当前细胞治疗模式：自体和同种异体方法的临床疗效
MSCs 与 iPSC：治疗应用潜力
在过去的 20 年里，间充质干细胞 (MSC) 作为一种治疗多种疾病的独特方法引起了广泛关注。MSC 具有自我更新和多谱系分化能力、免疫调节和抗炎特性，使其能够在再生医学中发挥作用。此外，MSC 的致瘤性低且具有免疫特权，这使得同种异体 MSC 可用于治疗，而无需直接从患者身上采集 MSC。诱导性多能干细胞 (iPSC) 可以通过基因重编程从成体细胞中生成，并异位表达特定的多能因子。iPS 技术的进步避免了破坏胚胎来制造多能细胞，使其免于伦理问题。iPSC 可以自我更新并发展成大量特化细胞，使其成为再生医学的有用资源，因为它们可以从任何人类来源产生。 MSC 还被用于治疗感染 SARS-CoV-2 病毒的个体。由于 MSC 具有高致瘤性（可引发致癌转化），因此其临床试验比 iPSC 多。在这篇综述中，我们讨论了间充质干细胞和诱导性多能干细胞的概况。我们简要介绍了使用 MSC 和 iPSC 的治疗方法和 COVID-19 相关疾病。
使用IPSCS
遗传性周围神经病（IPN）是一组与各种基因突变有关的疾病，在周围神经的发育和功能中具有基本作用。在过去的十年中，从细胞生物学研究和转基因型和啮齿动物模型中获得的轴突和髓磷脂变性的分子疾病机制方面的显着进步促进了有前途的治疗策略的发展。但是，迄今为止尚无临床治疗。这种缺乏治疗表明，迫切需要在生物学和临床上相关的模型概括IPN。对于神经发育和神经退行性疾病，患者特异性诱导的多能干细胞（IPSC）是疾病建模和临床前研究的特别强大的平台。在这篇综述中，我们提供了有关不同体外人类细胞IPN模型的更新，包括传统的二维单一培养IPSC衍生物，以及使用微流体芯片，器官和组装的更复杂的基于人IPSC的系统的最新进展。
人类 iPSC 亚型定向分化为心房和心室心肌细胞
15. 将 Matrigel 包被的培养板和 hiPSC 培养基预热至 20-25 C。16. 从预包被的培养板中吸出 Matrigel 并加入 hiPSC 培养基（6 孔板每孔 2 ml）。17. 将 9 ml hiPSC 培养基加入到 15 ml 离心管中。18. 将低温小瓶直接转移到 37 C 水浴中并观察解冻过程。当管中大部分内容物解冻并仅剩下一小块冰时，迅速取出并用 70％ 乙醇彻底清洗。19. 小心地将细胞逐滴转移到准备好的带有培养基的 15 ml 离心管中。以 200 3 g 的速度离心 5 分钟。20. 小心吸出上清液。将沉淀物悬浮在 hiPSC 培养基（例如 1 ml）中，并接种到准备好的 Matrigel 包被的培养板上。前 24 小时加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin（最终浓度 2 m M）。21. 如果 24 小时后细胞附着良好，则用 hiPSC 培养基更换培养基。如果附着力较低，再加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin（最终浓度 2 m M），培养 24 小时。从第二天开始，每天更换培养基，每孔（6 孔）加入 2 ml hiPSC 培养基。继续“hiPSC 传代和维护”，步骤 1-8。
使用 iPSC 建模遗传性周围神经病的进展与挑战
遗传性周围神经病 (IPN) 是一组与各种基因突变有关的疾病，这些基因在周围神经的发育和功能中起着重要作用。在过去的 10 年里，通过细胞生物学研究和转基因苍蝇和啮齿动物模型，在识别轴突和髓鞘变性背后的分子疾病机制方面取得了重大进展，促进了有希望的治疗策略的发展。然而，迄今为止尚未出现临床治疗方法。缺乏治疗方法凸显了对更多生物学和临床相关模型的迫切需求，这些模型可以重现 IPN。对于神经发育和神经退行性疾病，患者特异性诱导多能干细胞 (iPSC) 是疾病建模和临床前研究的一个特别强大的平台。在这篇评论中，我们提供了不同体外人类细胞 IPN 模型的最新信息，包括传统的二维单一培养 iPSC 衍生物，以及使用微流体芯片、类器官和组装体的更复杂的人类 iPSC 系统的最新进展。
高效 CRISPR/Cas9 介导全色盲患者来源的 iPSC 中纯合突变的校正
摘要：全色盲是一种常染色体隐性遗传病，患者视锥细胞会逐渐退化，导致色盲和视力下降，以及其他严重的眼部病变。它属于一类遗传性视网膜营养不良症，目前尚无治疗方法。尽管一些正在进行的基因治疗研究报告了功能改善，但仍应开展更多努力和研究以增强其临床应用。近年来，基因组编辑已成为个性化医疗最有前途的工具之一。在本研究中，我们旨在通过 CRISPR/Cas9 和 TALENs 技术纠正全色盲患者 hiPSC 中的纯合 PDE6C 致病变异。在这里，我们展示了 CRISPR/Cas9 的高基因编辑效率，但 TALENs 近似值不高。尽管少数经过编辑的克隆表现出杂合的靶向缺陷，但具有潜在恢复的野生型 PDE6C 蛋白的校正克隆的比例占所分析克隆总数的一半以上。此外，它们中没有一个出现脱靶畸变。这些结果对单核苷酸基因编辑的进展和未来治疗全色盲的策略的发展做出了重大贡献。
诱导性多能干细胞 (iPSC) 和基因治疗
摘要：迄今为止，基因治疗一直采用病毒载体来传递治疗基因。然而，分子和细胞生物学的最新进展彻底改变了干细胞和基因治疗领域。几年前，临床试验开始使用干细胞替代疗法，诱导多能干细胞 (iPSC) 技术与 CRISPR-Cas9 基因编辑相结合，开启了神经系统疾病基因治疗的新时代。在这里，我们总结了该研究领域的最新发现并讨论了它们的临床应用，强调了最近的研究在开发创新干细胞和基因编辑治疗方法方面的相关性。尽管致瘤性和免疫原性是现有的障碍，但我们报告了最近的进展如何解决它们，使工程干细胞移植疗法成为一种现实的选择。
使用 Edit-R 试剂在 iPSC 中敲入 SNP 改变。
图 2：使用核转染提供的 Cas9-mRNA 核酸酶、合成 sgRNA 和 ssDNA 寡核苷酸修复模板对 iPSC 进行基因编辑不会对 iPSC 形态造成干扰，可用于对基因组进行微小改变。A) 核转染后 48 小时拍摄的相位图像。比例尺为 100 μm。BC) 分析 LMNA 基因座 (B) 和 MYH7 基因座 (C) 中具有指定所需编辑 (蓝色) 或不需要的 INDEL (灰色) 的总 NGS 测序读数百分比。
IPSC中使用CRISPR的高效精确基因组编辑方法
基因组编辑是生物技术领域中开发的最强大的工具之一。改变生物体的基因组的能力使科学家能够在更复杂的系统中研究挑战性的进化和药用问题1。全基因组关联研究（GWAS）产生了大量的单核苷酸多态性（SNP），与疾病风险增加相关的遗传变异2。基因编辑允许生产含有SNP的基因工程的同源线，这些细胞可能说明了这种遗传突变如何引起疾病。编辑水平从理论上简单的基因敲除到更复杂的编辑，例如完整的基因插入或点突变。尽管基因组编辑技术已经快速提高，但仍未解决的几个挑战3 - 5。群集定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）已成为动植物模型中基因组编辑的首选方法6。当前方法通常使用核酸酶变体Cas9和cas12a 6。CRISPR -CAS9和-CAS12A系统与指南RNA（GRNA）相互作用，该导向RNA（GRNA）由两个段组成：CRISPR RNA（CRRNA）指定基因组靶点位点和反式激活CRISPR RNA（TRACRRNA），这些crispr rna（tracrRNA）直接与CAS与CAS核蛋白结合以形成核糖核蛋白蛋白（RNP）7。与先前的基因改变技术相比，创新的CRISPR-CAS基因编辑技术更简单，更负担得起配置，从而导致了广泛的利用率2、8、9。我们假设我们可以通过抑制p53激活，从而提高编辑效率来改善细胞恢复。然而，尽管CRISPR-CAS编辑系统取得了重大进展，但迫切需要进一步的优化以提高效率和成功编辑的百分比，尤其是当多种风险变体与感兴趣的基因相关联时，就需要通过敲击多个遗传修饰的多种SNP产生具有不同SNP的多线。在这项研究中，我们旨在开发一种高效且易于适应的基因编辑方案，以克服目前限制细胞系中点突变效率的障碍。由于与CRISPR和单细胞克隆10相关的双链染色体断裂而引起的明显细胞死亡。另一方面，据报道，抑制相关激酶（岩石）或p53途径可通过预防细胞死亡8来提高编辑效率8。