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患者指南：与您的医生一起理解报告
FoundationOne®CDx (F1CDx) 是一种基于下一代测序的体外诊断设备，用于检测 324 个基因中的替换、插入和删除变异 (indel) 和拷贝数变异 (CNA) 以及选定的基因重排，以及基因组特征，包括微卫星不稳定性 (MSI) 和肿瘤突变负担 (TMB)，使用从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肿瘤组织标本中分离的 DNA。该测试旨在作为伴随诊断，用于根据批准的治疗产品标签识别可能从表 1 中列出的靶向疗法中受益的患者。此外，F1CDx 旨在提供肿瘤突变分析，供合格的医疗保健专业人员根据肿瘤学专业指南针对实体恶性肿瘤患者使用。表 1 中未列出的基因组学发现并非任何特定治疗产品的标示用途的规定性或决定性发现。
FoundationOne®CDx 报告指南
FoundationOne®CDx (F1CDx) 是一种基于下一代测序的体外诊断设备，用于检测 324 个基因中的替换、插入和删除变异 (indel) 和拷贝数变异 (CNA) 以及选定的基因重排，以及基因组特征，包括微卫星不稳定性 (MSI) 和肿瘤突变负担 (TMB)，使用从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肿瘤组织标本中分离的 DNA。该测试旨在作为伴随诊断，用于根据批准的治疗产品标签识别可能从表 1 中列出的靶向疗法中受益的患者。此外，F1CDx 旨在提供肿瘤突变分析，供合格的医疗保健专业人员根据肿瘤学专业指南针对实体恶性肿瘤患者使用。表 1 中未列出的基因组学发现并非任何特定治疗产品的标示用途的规定性或决定性发现。
EnGen 突变检测试剂盒 E3321 手册
EnGen 突变检测试剂盒提供用于检测靶向基因组编辑事件的试剂。第一步，使用 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix 扩增基因组被靶向的细胞（即 CRISPR/Cas9、TALEN、锌指核酸酶）的目标区域。变性和重新退火后，当扩增子池中存在插入和缺失 (indel) 突变时，会形成异源双链。第二步，退火的 PCR 产物用 EnGen T7 核酸内切酶 I 消化，这是一种结构特异性酶，可识别大于 1 个碱基的错配。当存在错配时，DNA 的两条链都会被切断，从而形成较小的片段。对所得片段的分析可以估计基因组编辑实验的效率。
EdiTyper：一种用于分析基因组编辑实验中的靶向测序数据的高通量工具
基因组编辑实验正在生成越来越多的靶向测序数据，其中的特定突变模式表明实验的成功和克隆细胞系的基因型。我们介绍了 EdiTyper，这是一种高通量命令行工具，专门用于分析来自 CRISPR 基因编辑的多克隆和单克隆细胞群的测序数据。它只需要简单输入测序数据和参考序列，并提供全面的输出，包括汇总统计数据、图表和 SAM/BAM 比对。模拟数据分析表明，EdiTyper 在检测单核苷酸突变和插入缺失方面非常准确，对测序错误具有很强的鲁棒性，并且速度快且可扩展到大型实验批次。EdiTyper 可在 github（https://github.com/LappalainenLab/edityper）上根据 MIT 许可证获得。
奥尔堡大学高效基因编辑策略......
马铃薯 ( Solanum tuberosum ) 是一种高度多样化的四倍体作物。优良品种杂合性极强，品种内和品种间短片段多态性 (indel) 和单核苷酸多态性 (SNP) 的发生率很高，在 CRISPR/Cas 基因编辑策略和设计中必须考虑这些因素才能获得成功的基因编辑。在本研究中，对马铃薯品种 Saturna 和 Wotan 中葡聚糖水双激酶 (GWD)1 和抗霜霉病 6 (DMR6-1) 基因分别进行深入测序，结果显示与杂合二倍体 RH 基因组序列相比，四倍体与二倍体相比，存在 indel 和 1.3 – 2.8 的高 SNP 发生率。这使向导 RNA (gRNA) 和诊断性 PCR 设计变得复杂。细胞库（原生质体）水平的高编辑效率对于实现四倍体中的完全等位基因敲除以及减少下游繁琐而精细的植株再生至关重要。在这里，CRISPR/Cas 核糖核蛋白颗粒 (RNP) 通过聚乙二醇 (PEG) 介导的转化瞬时递送到原生质体中。对于 GWD1 和 DMR6-1 中的每一个，设计了 6 – 10 个 gRNA 来靶向包含两个基因的 5 ' 和 3 ' 端的区域。与包括多种生物体的其他研究类似，单个 RNP/gRNA 的编辑效率差异很大，并且一些产生了特定的插入/缺失模式。尽管与靶向 3′ 端相比，靶向 GWD1 5′ 端的 RNP 产生的编辑效率明显更高，但 DMR6-1 5′ 端和 3′ 端的编辑效率似乎有些相似。当仅靶向 GWD1 基因的 3′ 端时，同时用两个 RNP 靶向 5′ 端或 3′ 端（多路复用）对总体编辑产生了明显的正协同效应。与单个 RNP/gRNA 转化中获得的编辑效率相比，位于不同染色体上的两个基因的多路复用对单个 RNP/gRNA 编辑效率没有影响或略有负面影响。这些初步发现可能会引发更大规模的研究，以促进和优化植物的精准育种。
基因组编辑的当前状态及其含义
基因组编辑涉及使用定位的核酸酶（例如锌指核酸酶，Talens或CRISPR/CAS9）切割DNA双螺旋，并在基因组DNA中的靶向，特定序列引入双链断裂（DSB）。实际上是一对成熟的分子剪刀。然后，使用两种机制之一，通过细胞中的机械修复DSB。一种方法是非同源末端连接（NHEJ），其中两个破裂的末端彼此并排并粘合在一起。此方法容易出错，并且由于维修过程中不可避免的错误，在目标裂解位点会导致目标切割部位的插入和缺失（Indels）。这些误差会改变核酸酶目标位点，并防止进一步的切割事件，并通常禁用或敲除基因功能。另一种修复机制是使用同源核酸修复模板的同源指导修复（HDR）。修复模板可以设计与DSB两侧匹配的同源性区域之间进行所需的修改。这可用于引入一系列基因组编辑，从点突变到全基因插入。
高效 CRISPR/Cas 介导的靶向诱变......
CRISPR/Cas 技术近期已成为植物基因功能研究和作物改良的首选分子工具。小麦是一种全球重要的主粮作物，其基因组已被充分注释，使用基因组编辑技术（如 CRISPR/Cas）有很大空间改善其重要的农业性状。作为本研究的一部分，我们针对六倍体小麦 Triticum aestivum 中的三个不同基因：春季品种 Cadenza 中的 TaBAK1-2 以及冬季品种 Cezanne、Goncourt 和 Prevert 中的 Ta- eIF4E 和 Ta-eIF(iso)4E。已成功生成所有目标基因的携带 CRISPR/Cas 诱导的插入/缺失的原代转基因系。由于冬小麦品种通常不太适合遗传转化，本研究中介绍的冬小麦转化和基因组编辑的成功实验方法将引起研究该作物的研究界的兴趣。
参考材料8391
（HG-002）此参考材料（RM）用于验证，优化和过程评估目的。它由一个来自个人基因组项目（ID HUAA53E0）的东欧Ashkenazi犹太血统的男性全人基因组样本组成，可以用来评估基因组测序的变体呼叫的性能。RM 8391的单位由一个含有人类基因组DNA的小瓶组成，该小瓶从单一的大生长人类淋巴母细胞系GM24385（标记为HG-002）中提取，从科里尔医学研究所（Camden，NJ）中提取。小瓶含有大约10 µg的基因组DNA，DNA在Te缓冲液中（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）。该材料旨在通过获得真实阳性，假阳性和假阴性的估计来评估人类基因组测序变体的性能。测序应用可以包括整个基因组测序，整个外显子组测序以及更多靶向测序，例如基因面板。该基因组DNA旨在以与实验室处理和分析提取的DNA相同的方式进行分析。由于RM是提取DNA的，因此它对于评估诸如DNA提取等分析前步骤没有用，但是它确实挑战了测序库制备，测序机以及映射，对齐和变体调用的生物信息学步骤。此RM并非旨在评估随后的生物信息学步骤，例如功能或临床解释。信息值：为单核苷酸变化（SNV），小插入和缺失（Indels）和纯合参考基因型提供信息值。v3.3.2基准集覆盖了GRCH37组件的88％，使用参考文献1中描述的方法。一个信息值被认为是对RM用户感兴趣和使用的值，但是信息不足以评估与该值相关的不确定性。我们使用当前可用的数据和方法来描述和传播对基因型的最佳，最自信的估计。随着新的数据积累，测量和信息学方法的可用，这些数据和基因组特征将随着时间的流逝而保持。HG-002的数据可以在国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取存档中的BioSample SAMN03283347下找到。信息值作为一个变体调用文件（VCF），其中包含基准SNV和小indels，以及描述基准区域的TAB划分的“床”文件，其中任何其他变体在基准VCF中没有任何其他变体都应是错误。信息值不能用来建立计量学可追溯性。本报告中引用的文件可在国家生物技术信息中心（NCBI）托管的FTP站点的基因组中获得。基准VCF和基准区域的FTP站点中的基因组是：
使用长ssDNA模板进行同源指导修复的IPS细胞中有效的基因敲击蛋白
CRISPR/CAS技术的常见应用涉及工程基因敲击素，其中DNA序列被取代或插入特定的基因组基因座。In contrast with CRISPR-mediated indels, which result from the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) pathway, gene knockins are often engineered via homology-directed repair (HDR), typically through the use of CRISPR reagents (Cas enzyme and guide RNA) in tandem with a DNA template that shares homology with the target site and encodes for the desired modification (Hsu et al., 2014;图1，下面）。用于HDR的模板可以是双链DNA（DSDNA，线性或质粒）或单链DNA（SSDNA），并且最近的发现表明，修复机制取决于使用的模板类型而变化。 dsDNA触发了一种反映减数分裂同源重组（HR）的RAD51依赖性机制，而HDR涉及ssDNA（称为单链模板修复或SSTR）是Rad51独立的，并且需要多个组件，并且需要多个组成部分的Fanconi Anemia Anemia（FA）维修路径（RICHARDARDSON ERATHEWAY（RICHARDARSEN）等。
引用：Yang，W.，Qi，W.，Li，Y.，Wang，J.，Luo，Y.，Ding，D.，Mo，S.，Chen，B.，Lu，Y. （2021）。编程的顺序切割endows
CRISPR/CAS9介导的基因组编辑技术引发了生物学研究的革命（Jinek等，2012）。cas9与指南RNA在精确的位置上切割DNA，并通过包括动物和植物在内的高层真核细胞中的非同源末端连接（NHEJ）途径有效地修复所得的双链断裂（DSB）。由于NHEJ的维修过程是容易出错的，因此结果结果主要是框架之外的事件。因此，CAS9主要被认为是一种高度效力的“敲除”工具，并深深地认为无法在没有重大修改的情况下形成框架基础转换。结果，框架内的基础变化必须依赖于脱氨酶介导的基础编辑器（Komor等，2016; Gaudelli等，2017），主要编辑工具（Anzalone等，2019）或通过同源指导性维修或NHEJ通过供体DNA模板的低效率融合。最近，越来越多的证据表明，NHEJ修复结果是非随机且可预测的（Shen等，2018； Allen等，2018； Chen等，2019）。的确，众所周知，即使在同一切割部位， +1/–1 bp indels也常常主导NHEJ修复结果。我们突然意识到