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野生葡萄藤的质体基因组学（Vitis Vinifera subsp。...
种类葡萄葡萄（常见的葡萄）分为两个子种：Vitis Vinifera subsp。vinifera（培养的葡萄）和Vitis Vinifera subsp。sylvestris（野葡萄）。Vitis Vinifera subsp。Vinifera广泛用于餐桌水果，并作为生产与葡萄相关饮料的主要来源，包括葡萄酒和醋。野葡萄（Vitis Vinifera subsp。sylvestris）引起了人们的极大兴趣，因为它们被认为是培养品种的祖细胞，并且是一般理解葡萄树驯化过程的关键。为了解锁葡萄藤驯化的分子机制，基于基因组的研究被广泛进行。在这项研究中，两个格鲁吉亚野生葡萄树样品的完整叶绿体基因组受到光照射测序和计算机基因组组装，然后进行基因注释。根据结果，每个分析的叶绿体基因组的长度为160.928 bp，共有128个基因（83个蛋白质编码，37个tRNA，8 rRNA），属于遗传上独特的“ rkatsiteli'rkatsiteli'haplotype（AAA）。一项比较基因组研究揭示了叶绿体基因组中某些插入和SNP的存在。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
CRISPR-Cas9 系统的基因毒性。
摘要：基因治疗是治疗单基因疾病的一种很有前途的治疗策略。虽然第一种方法被称为添加剂，是基于病毒载体的使用，但现在越来越多的人开始转向基因编辑。这是通过新一代核酸内切酶，特别是 CRISPR-Cas9 系统的发展实现的。在 CRISPR-Cas9 系统被鉴定后不到十年，它就使得基因编辑进入临床成为可能。然而，在同一时间范围内，人们对 Cas9 可能引起的基因毒性提出了一些疑问。新兴文献指出目标部位存在基因毒性的风险。这里介绍的论文就属于这个主题。该研究的第一部分旨在描述 Cas9 造成的单个双链断裂所引起的基因毒性。通过监测 HDR/InDels 平衡，在核苷酸水平上表征了这些影响，也在染色体水平上进行了表征。染色体完整性的监测突显了一种尚未表征的新的遗传毒性风险。针对这种风险，我们已经开发出一种灵敏且特异的检测系统，以继续对其进行表征。第二个目标是利用 Cas9 D10A 切口酶独特的单链断裂来开发一种更安全、同样有效的基因编辑方法，解决不良基因毒性引起的局限性。
基于 RNP 的原代 CD4+T 细胞编辑...
电穿孔后 72 小时，可使用 BioLegend APC 抗人 TCR α / β 抗体通过流式细胞术评估用靶向 Edit-R sgRNA RNP 的 TRAC 或 TRBC 编辑的原代 CD4 + T 细胞的 TCR α / β 敲除情况。除了通过流式细胞术读取表型外，在基于 RNP 的编辑后 48-72 小时内，可以通过 T7EI/TIDE 测量插入/缺失形成。使用表 1 中列出的每个经过验证的 sgRNA 的引物，遵循 Dharmacon™ Edit-R™ 合成 gRNA 阳性对照试剂盒方案中的直接细胞裂解和 PCR 条件。要测量 T7EI 内切酶的插入/缺失形成，请完成上面列出的方案并使用分析软件。要通过分解 (TIDE) 分析跟踪插入/缺失来测量插入/缺失形成，请将得到的 PCR 扩增子发送至 Sanger 测序并使用网络工具，例如 http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 。以下方案描述了用于通过流式细胞术评估原代 CD4 + T 细胞中 TCR α / β 表型敲除的染色条件。1. 通过离心（300-5 分钟）沉淀用 PPIB、NTC2、TRAC 或 TRBC 靶向 RNP 电穿孔的 CD4 + T 细胞
利用牛津纳米孔技术公司的自适应采样技术进行药物基因组学中的靶向单倍型分析
药物基因组学 (PGx) 研究个体间基因组变异对药物反应的影响，从而有机会为每位患者量身定制给药方案。目前有针对性的 PGx 测试平台主要基于微阵列、聚合酶链式反应或短读测序。尽管这些检测在识别单核苷酸变异 (SNV) 和插入/缺失 (INDEL) 方面表现出巨大价值，但它们无法识别大的结构变异，也无法进行明确的单倍型分型以进行星号等位基因分配。在这里，我们使用 Oxford Nanopore Technologies 的自适应采样来丰富从药物基因组学知识库 (PharmGKB) 中提取的具有充分记录的 PGx 相关性的 1,036 个基因面板。通过评估与现有真实集的一致性，我们展示了对五个瓶中基因组参考样本的准确变异和星号等位基因调用。我们表明，最多可以在一个 PromethION 流动槽上复用三个样本，而不会显著降低变异调用性能，从而分别实现 99.35% 和 99.84% 的目标变异召回率和精确度。这项工作推动了纳米孔测序在临床 PGx 环境中的使用。
引用Shiota Y，Nishiyama T，Yokoyama S，Yoshimura Y，木谷C，田中S，Iwasaki S和Kikuchi M（2024），《遗传变体与AU
自闭症谱系障碍（ASD）是一种常见的神经发育障碍，其特征是社会交流和受限，重复行为或利益受损（Masi等，2017; Lord等，2018; Hirota and King，King，2023）。在美国，ASD影响了8岁儿童约2.3％（Hirota and King，2023）。ASD的一个重要方面是其异质临床特征。例如，有些人表现出智力障碍（ID）和有限的语言能力，而另一些人则表现出运动障碍（Hirota and King，2023年）。这种异质性归因于多种遗传变异和环境因素（Baron-Cohen，2017； Bai等，2019）。遗传变异与等位基因效应大小和种群频率不同。此外，遗传变异存在于连续体中，从单核苷酸变化到染色体水平的基因组变化。小规模的变化包括单核苷酸多态性（SNP）以及短DNA序列的插入或缺失（indels），而典型的大规模变化包括拷贝数变化（CNV）和染色体重排（Sebat等，2007）。通常，稀有变体的效果大小比共同变体具有更大的效果大小（Grove等，2019）。存在许多具有不同效应大小和等位基因频率的变体，以及它们与环境因素的相互作用，产生了ASD的高度复杂的遗传结构（Timpson等，2018）。有针对性的面板测序允许对具有高灵敏度的变体有效检测（Mellone等，2022）。尽管全基因组和全异常下一代测序（NGS）已被用于对这种多基因疾病的全面分析，但这些方法相对昂贵（Mellone等，2022）。迄今为止，几项大型队列研究已经确定了越来越多的ASD相关遗传变异。已使用全基因组测序和传播和从头结合的测试确定了超过一千个ASD相关的稀有变体（Murtaza等，2022）。通过外来分析的日本人口分析，Kimura等人。（2022）识别稀有突触功能相关的变体。但是，这些大型队列研究可能包括具有不同程度的自闭症特征和ID严重程度的个体。此外，遗传变异与单个ASD特征之间的关系，例如语音发展，社会反应能力和智力，在很大程度上尚未得到探索。在这项研究中，我们进行了病例对照NGS分析，并对日本ASD儿童进行心理评估，主要是具有高功能自闭症（HFA）。由于HFA不被认为是独特且绝对的诊断类别，因此我们将其评估为ASD的一种形式，在表型中是高度异质的。患有智能商（IQ）为70或以上的ASD的儿童被定义为具有HFA的儿童（Alvares等，2020）。使用基于短阅读的方法，我们分析了SNP和简短的Indels，无论它们在人口频率上是罕见还是常见。我们旨在通过阐明与ASD相关的变体与个体ASD特征之间的关系来进一步了解ASD。
通过AAV6介导的供体递送在人诱导的多能干细胞中增强的内源基因标记
在人类诱导的多能干细胞（HIPSC）中，系统地对内源性蛋白进行了带有荧光标记的内源性蛋白，可以观察到不同细胞态中的活细胞动力学。然而，通过CRISPR/CAS9诱导的编辑将氟化蛋白的精确插入到活细胞中依赖于同源指导的修复（HDR）。非同源末端连接（NHEJ）DNA修复途径通常胜过HDR，导致不可逆的内部和缺失（Indels）和低敲门效率。识别成功的HDR介导的标记事件是当目标基因在干细胞中未表达并且成功的标记可能不会立即观察到的靶基因是一个额外的挑战。为了解决这些挑战，我们使用了：1）在优化的感染多重性（MOI）下，与腺相关的病毒血清型6（AAV6）介导的DNA供体以最大的效率提供标签有效载荷； 2）滴定的多重CAS9：GRNA核糖核蛋白（RNP）量确保条件之间的HDR/indel频率平衡； 3）长放大液滴数字PCR（DDPCR），以测量编辑池中HDR产生的等位基因的频率； 4）同时推断CRISPR编辑（ICE）以检测并避免与Indels明显饱和（> 50％）。这些方法使我们能够确定有效，准确的编辑条件并恢复带有标记的单元，包括在干细胞中未表达的位点标记的单元。这些步骤共同使我们能够开发出有效的方法和工作流程，直接从具有最佳HDR和最小化indel频率的理想细胞池的克隆分离。使用这种方法，我们同时实现了荧光标记物和双重插入到四个基因中的基因，这些基因在差异过程中被打开，但最初在HIPSC中未表达，在HIPSC中，基于荧光基于荧光的标记细胞的直接选择是不可能的：TBR2，TBR2，TBXT，CDH2，CDH2，CDH2，CDH2，CDH2，CDH2（PROFEFFEREDIATION和MEGREDIATION和MEGREGRIATION和MEGRGIAL egratiation and Moggratial Genes and Cdhees and Cdhh5）and Cdhh5（cdh5）和CDH5（cdh）5（cdh）5（cdh）5（cdh5）。通过对各种GRNA序列和RNP浓度的系统评估，我们确定了达到高HDR频率的每个基因的条件，以38.6％的峰值达到峰值，同时还避免了与Inderels相关的条件，在这种情况下，很难在带有统一的等位基因中具有标记等位基因的克隆的隔离。过度，该方法提高了在hipscs中未表达的基因的荧光敲击的效率，对细胞过程的基于可靠的基于图像的观察，并可以恢复精确编辑的单声道和双重标记的克隆。我们将这些方法标准化，以产生有效且一般的工作流程，以将大型HDR介导的敲入引入HIPSC中。
蛋白酶体的小分子抑制剂可提高 CjCas9 蛋白的稳定性
CjCas9 体积小，更容易载体化用于体内基因治疗。然而，与 SpCas9 相比，CjCas9 在靶基因中产生插入/缺失的效率通常较低。影响其功效的因素尚未确定。我们观察到，在 CMV 启动子下将该转基因转染到 HEK293T 细胞后，CjCas9 蛋白的表达量远低于相同条件下的 SpCas9 蛋白。因此，我们评估了蛋白酶体抑制剂对 CjCas9 蛋白稳定性及其对 FXN 基因编辑效率的影响。Western 印迹显示，添加 MG132 或硼替佐米可显著提高 HEK293T 和 HeLa 细胞中的 CjCas9 蛋白水平。此外，硼替佐米增加了在比 CMV 弱但对某些组织具有特异性的启动子（如 CBH 或 EFS）下表达的 CjCas9 蛋白的水平。最后，ddPCR定量分析显示硼替佐米处理增强了CjCas9在HEK293T细胞中敲除FXN基因GAA重复序列的效率，CjCas9蛋白稳定性的提高有利于其在CRISPR/Cas系统中的应用。
合成 CRISPR/Cas9 试剂促进基因组编辑...
CRISPR/Cas9 已成为斑马鱼基因组编辑的有力工具，它允许使用 DNA 模板和同源定向修复 (HDR) 快速产生功能丧失突变和特定等位基因的敲入。我们检查了合成的、化学修饰的 gRNA 的效率，并证明与重组 Cas9 蛋白结合可诱导插入缺失和大型基因组缺失。我们开发了一种体内遗传检测方法来测量 HDR 效率，并利用该检测方法来测试改变模板设计对 HDR 的影响。利用合成的 gRNA 和线性 dsDNA 模板，我们成功地在多个基因组位点进行了荧光团的敲入，并证明了以高效率通过种系传递。我们证明合成的 HDR 模板可用于敲入细菌硝基还原酶 (ntr)，以促进特定细胞类型的谱系消融。总的来说，我们的数据证明了结合合成 gRNA 和 dsDNA 模板在体内进行同源定向修复和基因组编辑的实用性。