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基础编辑的嵌合抗原受体Tcells
引言细胞工程正在彻底改变遗传疾病，自身免疫性疾病和癌症的治疗。早期基因编辑工具的出现，例如转录因子样核酸内切酶（Talens），锌纤维核酸酶和定期散布的短与短壁细胞（CRISPR）连续性重复序列（CRISPR） - 紧缩核酸酶相关的核酸酶9（CAS9），大大扩展了孔子的可能性，并扩大了临床的可能性 - 依次构成了依次的可能性。插入。6 - 11这些措施依赖于DNA双链断裂的形成，这些断裂主要是通过非同源性最终连接来修复的，以引入插入或缺失，这些插入或缺失破坏基因表达，或者通过同源指导的修复来介导基因整合。但是，尤其是当多路复用时，基因编辑可以导致非整倍性，染色体易位和显着的遗传毒性。1，12 - 15
使用 Dharmacon Edit- 对斑马鱼胚胎进行显微注射……
图 1：微注射 Edit-R Cas9 核酸酶 mRNA 和合成 crRNA:tracrRNA 的斑马鱼胚胎具有可检测的编辑事件。仅微注射 Edit-R Cas9 mRNA（+/+ 泳道）或微注射 Edit-R Cas9 mRNA 加靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA（+ 泳道）。注射后 2 天制备基因组 DNA，并使用位于切割位点两侧的引物进行 PCR。使用 T7EI 进行 DNA 错配分析，并在 2% 琼脂糖凝胶上分离样品。使用 ImageJ 软件估计由于基因编辑而导致的插入和缺失百分比 (Indel %)，并显示在泳道底部。在所分析的斑马鱼胚胎中，75% 实现了使用靶向 GFP 的 crRNA:tracrRNA 编程的 Cas9 mRNA 的靶向 DNA 切割。
CAS9变体特异性的高度平行分析
确定可编程核酸酶的脱靶裂解谱是任何基因组编辑实验的重要考虑因素，并且已经报道了许多提高特异性的CAS9变体。我们在这里描述了基于标记的标签积分位点测序（TTISS），这是一种有效的，可扩展的方法，用于分析我们在59个目标中与八个CAS9变体平行应用的双链断裂。此外，我们生成了数千种其他CAS9变体，并筛选了具有增强特异性和活动的变体，识别LZ3 Cas9，这是具有唯一+1插入曲线的高特异性变体。这种全面的比较揭示了CAS9活动和特异性之间的一般权衡，并提供了有关+1插入频率的信息，这对校正移码突变具有影响。
重新组合：使用单链寡聚>的体内基因工程效率高度
重新组合提供了对任何DNA序列进行快速，精确和廉价的遗传改变的能力，无论是在染色体中还是克隆到载体上，以在大肠杆菌（或其他重新组合的培养细菌）中复制的载体，并以高效的方式进行。可以在重新组合的几天内创建不可能用体外基因工程制造的复杂遗传构建体。与单链DNA（ssDNA）重新组合可用于创建单个或多个聚类点突变，小或大（最大或最大（最高10KB）缺失）以及小（10-20个基本）插入（例如序列标签）。使用优化的条件，可以使用如此高的频率进行点突变，以至于无需选择就可以找到它们。这项技术在创建定向和随机突变方面表现出色。
EnGen 突变检测试剂盒 E3321 手册
EnGen 突变检测试剂盒提供用于检测靶向基因组编辑事件的试剂。第一步，使用 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix 扩增基因组被靶向的细胞（即 CRISPR/Cas9、TALEN、锌指核酸酶）的目标区域。变性和重新退火后，当扩增子池中存在插入和缺失 (indel) 突变时，会形成异源双链。第二步，退火的 PCR 产物用 EnGen T7 核酸内切酶 I 消化，这是一种结构特异性酶，可识别大于 1 个碱基的错配。当存在错配时，DNA 的两条链都会被切断，从而形成较小的片段。对所得片段的分析可以估计基因组编辑实验的效率。
Engen突变检测试剂盒E3321手册
ENGEN突变检测试剂盒提供了用于检测目标基因组编辑事件的试剂。在第一步中，使用Q5热启动High-Fidelity 2X Master Mix放大了来自基因组的靶向区域（即CRISPR/CAS9，TALES，锌指核酸酶）。在变性和重新进行重新进行后，当插入和缺失（Indels）中存在于扩增子池中时，就会形成异质化合物。在第二步中，将退火的PCR产物用Engen T7核酸内切酶I消化，这是一种特定于结构的酶，将识别大于1碱基的不匹配。存在不匹配时切割DNA的两个链，从而导致形成较小的片段。对所得片段的分析提供了基因组编辑实验效率的估计。
中心氧气
SNV：单核苷酸变体； Indels：小插入/删除； CNV：副本编号变化； UPD：单亲疾病； mtDNA：线粒体DNA * CNV检测软件灵敏度> 95％；但是，对于重复和同源区域（例如伪基因）以及跨越两个或更少外显子的事件，可能会降低这种敏感性。**质量低和/或不清楚的变体通过正交方法确认：SNV和Indels通过Sanger测序； CNVs by Multiplex ligation-dependent probe amplification (MPLA), quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or chromosomal microarray (CMA) *** Screening of UPD is performed using an in-house algorithm for Mendelian Inheritance Errors (MIE) to detect runs of homozygosity (ROH) for the well-known clinically relevant chromosomal regions Guaranteed internal必要时使用CMA进行验证测试。
DNA组装与合成生物学
用户友好的DNA工程方法可以实现多个PCR片段组件，核苷酸序列改变和定向克隆。靶DNA分子和克隆载体由PCR产生，而相邻片段之间具有6-10个同源性碱基。pCR引物包含一个二氧化神经菌残基（DU），该残基（DU）在同源性区域的3´末端，可以容纳核苷酸取代，插入和/或缺失。然后使用引物用离散的重叠片段扩增向量和靶DNA，这些片段在两端都包含DU。随后使用用户酶对PCR片段进行处理会在每个DU上产生一个单个核苷酸间隙，从而导致PCR片段侧翼，侧面有SS延伸，使定制DNA分子的无缝和方向组装成线性化的载体。多碎片组件和/或各种诱变变化。
数字液滴 PCR 和 IDAA 用于检测疟疾物种斯氏按蚊中的 CRISPR 插入/缺失编辑
摘要 CRISPR/Cas9 技术是设计基因驱动系统以控制和/或改变蚊媒种群的有力工具；然而，CRISPR/Cas9 介导的非同源末端连接突变可能对产生抗驱动的等位基因产生重要影响，从而对驱动效率产生重要影响。我们展示并比较了两种技术在疟疾媒介蚊子斯氏按蚊中的插入或缺失 (indel) 检测能力：扩增子分析插入缺失检测 (IDAA™) 和液滴数字™ PCR (ddPCR™)。这两种技术在含有不同比例和不同大小的插入缺失的蚊子样本中都显示出插入缺失频率的准确性和可重复性。此外，这些技术具有优势，使它们可能更适合在基因驱动蚊子的笼养试验和封闭式现场测试中进行高通量非同源末端连接分析。
氮原子插入麦诺尔以访问苯并e的
致力于开发用于制备苯唑骨骨骼的效果方法。单原子插入代表了杂环合成的最有趣的方法之一，并为获取有价值的苯并牙素建立了新的机会。在此，我们报告了一种反应，其中氮原子直接插入麦诺尔，以通过叠氮化物中间体产生相应的苯唑环环（图1d）。为了将氮原子插入舞台，我们建议利用艾尔诺尔作为底物，这可以破坏芳族环的稳定性。noLs可以用作位置选择性氮插入中的指导组。与苯环添加到32 - 35中不同，该策略有助于C - C键裂解，更重要的是，实现了现场选择性的氮原子插入。