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EP0402 TAQ DNA聚合酶（rec。）
图3。准备和使用病毒载体在靶细胞中重组蛋白表达。（1）包装细胞（例如HEK293）用编码感兴趣基因和必要病毒蛋白的三个或四个质粒转染。（2）将病毒组装在包装细胞中，然后收获和纯化。（3）该病毒用于转导靶细胞，释放感兴趣的基因。（4）在此示例中，将慢病毒载体的RNA反向转录为DNA，将DNA整合到宿主基因组中以进行重组蛋白表达。
Invitrogen™Neon™NXT电穿孔系统
仅用于研究使用。不适用于诊断程序。©2023 Thermo Fisher Scientific Inc.保留所有权利。除非另有说明，否则所有商标都是Thermo Fisher Scientific及其子公司的财产。col023914 0223
Invitrogen™ LentiArray™ 人类 CRISPR 文库，96 孔...
转导条件 • 您必须根据经验确定每种细胞系的转导条件和感染复数 (MOI)。如果需要共感染，我们建议对 Cas9 至 CRISPR 文库慢病毒颗粒使用 5–10 的 MOI 比率，以达到最佳基因敲除程度。 • 感染期间使用含较低水平 FBS（例如 3– 5% FBS）的培养基可能会增加某些细胞类型的转导效率。 • Polybrene™（六甲溴铵）可以将慢病毒转导到人细胞的效率提高 2–10 倍。您必须根据经验确定目标细胞的最佳 Polybrene™ 浓度（例如最大感染性，最小毒性）。我们建议使用浓度范围（2–8 µg/mL）对 Polybrene™ 耐受性进行初步测试。 • 如果您计划使用嘌呤霉素进行选择，则必须首先确定选择转导细胞所需的最佳嘌呤霉素浓度。抗生素批次、细胞类型、细胞生长动力学和细胞培养条件（包括细胞密度）会影响筛选所需的嘌呤霉素量。使用嘌呤霉素进行筛选通常需要 7-10 天。
Invitrogen转染产品
CRISPR-CAS9是一种用于基因组编辑和工程的既定方法，包括在对特定基因组裂解事件不完善的修复后，基因表达敲除诱导。Invitrogen™Lentipool V2人CRISPR文库已开发用于功能丧失研究，以确定基因在调节细胞过程中的作用以及对化合物，药物或任何可能影响这些过程的任何扰动者的细胞反应。Lentipool V2人类CRISPR库中包含的CRISPR-CAS9指南RNA（GRNA）是基于专有GRNA设计算法设计的，该算法选择指南以最大程度地敲除效率而不牺牲特异性。每个库包含每个基因的四个序列验证的不同的GRNA矢量构建体，包装为慢病毒颗粒。Lentipool V2人CRISPR库由定制或预定义集合的grnas组成，以特定基因家族为目标，以慢病毒合并格式进行功能基因组学筛选，请参见第29页。
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为了访问这些优化的基因组编辑方法，我们创建了Invitrogen™Truedesign™基因组编辑器，这是一种免费的在线工具，用于设计和订购基于CRISPR-Cas9的编辑。本申请说明描述了两种用例：（1）引入诱导多能干细胞（IPSC）（IPSC）和（2）用GFP标记β-肌动蛋白的LRRK2基因（G2019S）中的SNP变化。对于SNP变化，通过在线工具自动生成了单链寡核苷核苷酸（SSODN）供体的建议设计。对于融合蛋白，使用Invitrogen™TRUETAG™供体DNA试剂盒自动生成底漆建议，以自动生成双链供体DNA。供体DNA。此应用程序说明还描述了此转染过程的详细协议。一旦输送到细胞中，供体DNA将在不到一天的时间内将其集成到目标细胞的基因组中。
TrueDesign 基因组编辑器
对于使用 CRISPR 技术的敲除富集实验，设计步骤中选择的 gRNA 和 Invitrogen™ TrueTag™ 供体引物将自动包含在内。该工具还将添加 TrueTag Knockout Enrichment Donor DNA Kit，其中包含所需的供体模板、PCR 试剂和清理试剂盒，以生成可用于转染的供体 DNA。还包括 Invitrogen™ TrueTag™ 验证引物，用于进行连接分析，以确保供体模板正确插入。
果糖与葡萄糖：调节干细胞生长和通过补充糖的功能
试剂或资源源标识符化学品，肽和重组蛋白Puelink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A ISCRIPT™ISCRIPT™cDNA合成Kit Kit Biorad 1708840 Sybr™SELICS SYBR™SELECT MASTER MASTER MASTER MIST 4-12％，10井Genscript M00653胶原酶II Sigma C2-28-100MG DMEM（无葡萄糖）GIBCO GIBCO 11-966-025 FBS FISHER FISHER FISHER SCOCICILIFIC SH3010903 PENICILLIN SH30103 PhosSTOP Roche 4906845001 IBMX Sigma 410957 Insulin Sigma I5500 Indomethacin Sigma 405268 Triiodothyronine (T3) Sigma T6397 Dexamethasone Sigma 265005 Rosiglitazone Sigma PHR2932 LipidTOX deep red neutral lipid stain Fisher Scientific H34477超级阻止诱因37535抗体抗KHK Sigma HPA007040抗HIF1α（D2U3T）细胞信号传导14179抗PPARγ（C26H12）细胞信号2443 C/EBPα细胞信号8178 Anti-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-EBPα细胞信号8178 Anti-al timnigin-αtubin tim-αtubin（38）细胞信号2250质粒和siRNA PVSV-G添加剂138479 PCL-ECO ADDGENE 12371 PBABE-NEOLARGE TCDNA ADDGENE 1780人HIF1A 3091 sirna accell drm-a-a-a-a-004018230001生物。n/a
8197 医疗单
表型表征和血清分型内部检测表型方法：在选择性培养基和商业试剂上培养（如果需要，由 AMRHAI 提供 Mast、Pro-lab、MALDI-TOF 或 16S 测序）BRD0099 - 流感嗜血杆菌分离株的处理和鉴定以及 a-内酰胺酶的产生程序，BRD0100 - 流感嗜血杆菌的血清分型 PCR 用于确认流感嗜血杆菌物种 ID 和荚膜类型 DNA 提取：商业试剂（Instagene 树脂、BIORAD）、热块 PCR 扩增和可视化：基于块的 PCR、Veriti 热循环仪、Invitrogen PCR mastermix、Invitrogen E-gel、Syngene Gel Doc 系统。BRD0197 - 使用 InstaGene 基质（Bio-Rad）从细菌中提取 DNA BRD0103 - 通过 PCR 确认和鉴定流感嗜血杆菌物种和血清型
gmp 制造的 cas9 核酸酶细胞治疗 - ...
图 2. CTS Cas9 的 TCR 敲除效率高于供应商 A Cas9。将每个 Cas9 (7.5 pmol) 和靶向 alpha 和 beta T 细胞受体基因 (TRAC 和 TRBC) 区域的 Invitrogen ™ TrueGuide ™ 合成 sgRNA (7.5 pmol) 混合以创建 Cas9-RNP 复合物。每个 Cas9-RNP 复合物用于使用 Neon 转染系统 (货号 MPK5000) 转染 500,000 个 T 细胞。 72 小时后收获细胞，用 Invitrogen ™ eBioscience ™ 可固定活力染料 (FVD) 紫罗兰 (货号 65-0863-14) 和 eBioscience ™ 抗 TCR a/b 抗体 (货号 12- 9986-42) 染色，然后在 Invitrogen ™ Attune ™ NxT 流式细胞仪上进行分析，并使用基于 NGS 的 TAV 进行基因分型。 (A) TCR KO 效率的流式细胞术数据示例。与供应商 A Cas9 相比，CTS Cas9 的 KO 效率超过 88.7%，而供应商 A Cas9 的 KO 效率为 61.7%。 (B) 基于 NGS 的 TAV 的平均 KO 效率。与供应商 A Cas9 相比，CTS Cas9 在各种目标上实现了更高的平均 KO 效率。所有反应均重复进行三次 (** P < 0.01)。