在37°C,200 rpm时10分钟。RNA,并在冰上被5 µL冰冷1 N NaOH碎片碎片10分钟。用25 µl 1 M Tris-HCl(pH 6.8)中和后,将RNA再次用异丙醇沉淀。Biotin RNA被预洗的dynabeads™M-280链霉亲和蛋白珠(Invitrogen,#11206D)富含,被高盐缓冲液,分别降水缓冲液,低盐缓冲液洗涤,然后用Trizol和Zymo rna Clean&Compentor(Zymoresearch(Zymoresearch)(Zymoresearch)在珠子上提取。用20°C的100 µM VRA3 RNA适配器与1 µL的100 µM VRA 3 RNA连接过夜。然后将生物素RNA富集并再次提取。RNA通过RPPH(NEB,#M0356)在5'端修饰,并通过T4 PNK(NEB,#M0201L)进行了羟基修复。被Zymo RNA清洁和浓缩器提取后
图 1. CTS HiFi Cas9 蛋白 (CTS HF Cas9) 显著降低了原代 T 细胞中脱靶效应的发生率。将三种 Cas9 蛋白与三种 Invitrogen ™ TrueGuide ™ 合成 sgRNA 混合,形成九种复合物(RNP:50 pmol sgRNA、38 pmol Cas9、50 pmol dsTag,用于 Invitrogen ™ Neon ™ 转染系统中的 1.5 x 10⁶ T 细胞(100 µL)*)。使用 Neon 转染系统将每个 RNP 复合物递送到原代 T 细胞中。从 NGS TEG-seq 检测(点图)中获得每个 gRNA 的在靶和脱靶效应读数。每个脱靶/在靶比(蓝点)是根据单个脱靶的每百万读数 (RPM) 除以相应在靶的 RPM 计算得出的。红点代表相应的在靶,并标准化为 100%。 x 轴是任意的。CTS WT Cas9 是 CTS TrueCut Cas9 蛋白。
*此程序专门适用于转染源自 Bac-to-Bac 系统 (Invitrogen) 的杆粒 DNA。我们使用的杆粒 DNA 通常使用标准小量制备程序生成,如 Bac-to-Bac 用户手册中所述。我们发现使用商用小量制备试剂盒或柱子没有好处。
图1:使用一系列不同的基于珠子和自旋柱的提取试剂盒从1 mL血浆重复中提取的平均DNA产量(Ng)。cfDNA,并洗脱50 µL洗脱缓冲液。DNA浓度。
Dovetail®,DovetailGenomics®和Hirise®是美国和/或其他国家的Cantata Bio LLC的全资子公司Dovetail Genomics,LLC的商标。iLlumina®,HISEQ®,Miseq®,Miniseq®,ISEQ®,NextSeq®,NovaseQ®是Illumina,Inc。的注册商标。BeckmanCoulter™和Spriselect®是Beckman Coulter,Inc.Qubit®的商标或注册商标。Tapestation®和Bioanalyzer®系统是安捷伦技术的注册商标。Invitrogen®是Thermo Fisher Scientific Inc.的注册商标
批量描述01263642 0.5 KU TAQ DNA聚合酶(rec。)2655825 2 x 1.25 ml 10x TAQ缓冲液(NH4)2SO4 2667128 2 x 1.25 ml 10x TAQ缓冲液与KCl 2655522 2 x 1.25 ml 25mm 25mm 25mm mgcl2
使您能够编辑基因组中的任何位置图 1. 使用 TALXcell 平台敲除 T 细胞受体 (TCR)。使用 Invitrogen ™ Neon ™ 转染系统通过电穿孔将 TALXcell mRNA 递送至原代人类 T 细胞。使用藻红蛋白 (PE) 偶联的 TCR 抗体通过流式细胞术测量 TCR 敲除效率。TALXcell 平台实现了 94.9% 的 TCR 敲除效率,这与在类似实验中使用 CRISPR-Cas9 观察到的效率相似。
使用HSOP 461和HSOP 466(Spectratating GuideLine),使用T细胞的磁珠细胞分选 T细胞受体谱分型。 使用商业试剂盒(QIAGEN)的RNA提取以及遵循制造商的说明和内部标准操作程序HSOP499。 Reverse transcription for cDNA synthesis using commercial kit (Invitrogen) and in-house standard operating procedures HSOP 780 RT-PCR using HSOP 467 Fragment analysis HSOP 468 AutoMACS Pro (MiltenyiBiotec), GorScript TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Promega), QiagenHot Star Taq DNA Polymerase, G Storm 4 PCR machine and Proflex机器,3500XL遗传分析仪(FSOP 491)。T细胞受体谱分型。使用商业试剂盒(QIAGEN)的RNA提取以及遵循制造商的说明和内部标准操作程序HSOP499。Reverse transcription for cDNA synthesis using commercial kit (Invitrogen) and in-house standard operating procedures HSOP 780 RT-PCR using HSOP 467 Fragment analysis HSOP 468 AutoMACS Pro (MiltenyiBiotec), GorScript TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Promega), QiagenHot Star Taq DNA Polymerase, G Storm 4 PCR machine and Proflex机器,3500XL遗传分析仪(FSOP 491)。
实际上,2022年的分子纸表明,Thermo Fisher的Invitrogen E-Gel琼脂糖预制凝胶可以通过单个基于电泳的分析3。此方法大大简化了曾经是劳动密集型过程的内容。凝胶电泳中的创新增强了其可用性,使其更安全,更容易获得。预制凝胶消除了对危险化学物质和广泛准备的需求,使研究人员能够在几分钟而不是小时内获得准确的结果。Palaima指出,在其他用于Circrna分析的电泳工作流中,“如果您自己制作,则必须处理甲醛和其他真正令人讨厌的化学物质,因为您必须预防RNases