图1。用Truecut Cas9蛋白V2和相应的TrueGuide SGRNA对多个基因靶标的基因组编辑进行。使用优化的转染方案和脂肪切开胺CRISPRMAX转染试剂在两种细胞系中实现:A549,人类肺癌细胞系;和人类乳腺癌细胞系MDA-MB231。这些图还比较了使用其他供应商的产品和推荐协议比较相同的实验。使用Invitrogen产品,与其他供应商的产品和协议相比,低效基因座(PRKCG和CMPK1)的裂解效率得到提高,并显示出较高的效率,最高两倍。
Invitrogen™TRUECUT™Cas9蛋白用于使用CRISPR技术的基因组编辑应用。cas9蛋白与CRISPR-CAS9系统的引导RNA(GRNA)成分形成非常稳定的核糖核蛋白(RNP)复合物。纳入核定位信号(NLS)的掺入有助于其向细胞核的传递,从而增加了基因组DNA裂解的速率。与质粒系统相比,它可以迅速清除,从而最大程度地减少了脱靶裂解的机会(Liang等,2015)。与基于质粒的CRISPR系统相比,CAS9核酸酶已在多种悬浮液和粘附细胞系中进行了测试,并且显示出优异的基因组裂解效率和细胞的生存能力。
转染后 48 小时收获细胞。胰蛋白酶消化后,进行 FITC-膜联蛋白 V 和碘化丙啶 (PI) 染色。使用流式细胞术用膜联蛋白 V-FITC 和 PI 的死细胞凋亡试剂盒 (Invitrogen,目录号:V13242) 分离凋亡细胞 (早期)。单克隆抗体使用与绿色荧光 FITC 染料结合的重组膜联蛋白 V 检测凋亡细胞中磷脂酰丝氨酸的外化,使用 PI 检测死细胞,其中 PI 将坏死细胞染成红色荧光。用两种探针处理后,凋亡细胞显示绿色荧光,死细胞显示红色和绿色荧光,活细胞几乎不显示荧光。Navios
将细胞周期同步48小时,使用1 M甲氯酸酯释放细胞24小时。根据制造商的说明,我们使用了溴脱氧尿苷(BRDU)检测试剂盒(Roche细胞增殖ELISA,BRDU(化学发光)套件)。DRAQ7™(ABCAM,AB109202)添加到细胞中。HOECHST(Hoechst(Thermo Fisher Scientific™,Hoechst 33342溶液,Waltham MA)根据制造商的建议来对抗染色核。使用ImageXpress®PICO显微镜(Molecular Devices,San Jose,CA)对染色的细胞进行成像,并使用CellReporterXpress图像采集和分析软件进行分析。根据制造商的建议,使用了膜联蛋白V-PI(Invitrogen,Annexin v-Fitc结合物,Waltham MA)凋亡测定法,并通过流量
酶进行初始的一锅共轭,然后进行简单的缓冲交换,以删除未反应的有效载荷,然后再与2 nd有效载荷共轭。所有有效载荷以及高效率与重链上的酪氨酸残留物相结合(例如图3a),并在体外测试了感兴趣的细胞系。细胞抑制是通过Alamar Blue Assay(Invitrogen)测量了每种化合物在20个浓度点上建议的。在针对DS8201A(T-DXD)的头对头试验中,这些显示总抑制作用显着增加(图3C-E,图4 B,C)。最后,使用JIMT-1(HER2低)细胞系建立了乳腺癌的鼠模型。肿瘤达到100 mm 3小鼠后,用任何一个MPC
系统和JAVA Codon Adaptation Tool 进行密码子适配。优化后的序列由上海生工生物工程有限公司通过 BamH1 和 XhoI 酶切位点合成并克隆到来自 pGEX-6p-1 质粒(美国 Novagen)的表达载体中。将重组质粒 pGEX-6p-1-Mpro 转化的 E. coli BL21(DE3)细胞(美国 Invitrogen)在 2 L Luria-Bertani 培养基中于 37 ℃ 下生长至 OD600 达到 0.6 后,加入 0.2 mM IPTG,16 ℃ 诱导重组蛋白表达过夜。将菌体悬浮在 PBS 中,超声波破碎。离心收集上清液并与谷胱甘肽 Sepharose 4B 琼脂糖(美国 GE Healthcare)混合,4 ℃ 下孵育 3 h。然后用 PBS 清洗珠子,并加入 preScission 蛋白酶 (GE) 以切割 GST 标签。含有
产品编号 产品描述 单位大小 MPK1025 Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 25 x 2 rxn MPK10025 Neon 转染系统 100 µL 试剂盒 25 x 2 rxn MPK1096 Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 96 x 2 rxn MPK10096 Neon 转染系统 100 µL 试剂盒 96 x 2 rxn MPT100 Neon 转染管 100 管 我们鼓励您考虑转换到我们改进的 Invitrogen Neon NxT 电穿孔系统,该系统利用相同、可信赖的电穿孔技术,性能相当或更好。有关系统性能的更多信息,我们建议您查看 Neon 与 Neon NxT 比较应用说明。使用 Neon NxT 电穿孔系统,您将受益于 Neon 转染系统的以下相同方面:
source identifier dilution mouse anti human IFN- PE Biolegend 502509 1:100 mouse anti human TNF- Pe-Cy7 BD 557647 1:100 mouse anti human/mouse granzyme B BV421 Biolegend 396414 1:150 mouse anti human V 1 TCR PE eBioscience 12-5679-42 1:100 mouse anti human V 2 TCR PE Biolegend 331408 1:200 mouse anti human V 2 TCR APC Biolegend 331418 1:200 mouse anti human CD3 BV510 BD 563109 1:200 mouse anti human CD25 BV605 BD 562661 1:100 mouse anti human CD27 PE-Cy7 Invitrogen 25-0279-42 1:200 mouse anti human CD45RA PE BD 555489 1:200小鼠抗人CD69 BUV395 BD 564364 1:200小鼠抗人CD137 BUV661 BD 741642 1:200 231
浓度。DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国)、胎牛血清(Every Green,中国)、青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich,美国)、FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒和 7-AAD(BD Biosciences,美国)、CCK-8(Dojindo,日本)、DAPI(Beyotime,中国)、TRIzol 试剂(Invitrogen,美国)、First Stand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific,美国)和 UltraSYBR One-Step RT-qPCR Kit(Cwbio,中国)。所有引物均购自GeneScript(中国)。一抗p27(sc-71813)、CDK2(sc-53219)、Cyclin D1(sc-56302)、p53(sc-71819)、Bax(sc-20067)、Bcl-2(sc-56015)、cleaved PARP(sc-56196)和β-actin均购自Santa Cruz Biotechnology(美国),cleaved caspase-3[9661]和cleaved caspase-9(9505和9509)购自Cell signaling Technology(美国)。p53抑制剂(PFT-α,s2929)购自Selleck Chemicals(美国)。
所有的努力都是为了最大程度地减少苦难,同时还最大程度地减少了使用的动物数量。60只动物接受了缺血/再灌注手术程序(如下所述)。大鼠分为六组。对照组(C组,n = 15)接受了手术程序,但没有接受任何治疗干预措施,因为它们被DMEM-F12(Dulbecco修饰的Eagle Medium/ Mudientrient Mediument/ Dutrient Medient Cimbure FIF-12)接种了无菌输注(Gibco™Invitrogen Corporation,USA,USA,USA)。此外,一组被用作对照,旨在研究NGAL作为IRI生物标志物的准确性的潜在使用。健康组(H组,n = 15)保持在相同的条件下,但未提交手术程序或接受任何治疗。在其余三组中,进行缺血/再灌注手术程序,以及辛伐他汀(操纵,Viaflora,butitiba,curitiba)和/或ADSC输注,口服Simvastatin(S,n = 15),ADSC Infusion(SC,n = 15),ADSC Infusion + 1 SCC + SC + SC + SC + SC + SSC + SC + SC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC + SCSSSC,