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World File Search SystemInvitrogen
ARID1A参与胃癌的DNA双链断裂修复
使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）提取总RNA。使用Prime-Script RT试剂试剂盒（完美的实时，日本Takara）合成互补的DNA（cDNA）。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）用作内部对照基因，并使用2 – DDCT公式计算折叠诱导。使用SYBR Premix ex Taq进行定量实时PCR分析（日本Takara。Inc.目录编号DRR041A）（PCR协议：阶段1：早期讲述，重复：1;95℃30s阶段2：PCR反应，重复：40; 95℃5 s; 60℃30s阶段3：熔体曲线：熔体曲线：95℃15s; 60 s; 60 s; 60 s; 95 s; 95 s; 95 s;95℃15s）。使用了以下引物：ARID1A（F）5'-CTTCACTCAGTCAGCTCCCA-3'，arid1a（r）5'-GGTCACCCCACCCTCATCTCATACTCCTTT-3'，gapdh（f）5'-GGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCTCTCTCTCTCTCCTGATCTCAACA-3'，and gapdh（R） 5'-GTTGCTGCCCAAATTCGTTGT-3'。GAPDH用作内源性对照。每次三份重复每个样本，并使用相对定量软件（Applied Biosystems）分析。
造血干细胞中的非病毒基因组编辑（...
在各种生命科学应用中，通过转染细胞来改变其基因型或表型至关重要。有多种转染方法可供选择，而选择最佳方法通常取决于与特定应用的兼容性。电穿孔是一种物理转染策略，它使用电脉冲在细胞膜上创建临时孔，核酸或蛋白质可以通过这些孔进入细胞。它是一种高效而强大的工具，已被证明在基于基因编辑的有效载荷（如 CRISPR-Cas9 系统和 TALEN）方面具有出色的性能。赛默飞世尔提供研究级 Invitrogen™ Neon™ NxT 电穿孔系统（配备 10uL 或 100uL 试剂盒）和符合 GMP 标准的 CTS™ Xenon™ 电穿孔系统（配备 1mL SingleShot 或封闭式一次性 5-25 mL MultiShot 耗材）。这两种仪器都采用相同的核心技术。在这项研究中，我们已经证明这些平台具有高度灵活性，并且与具有不同有效载荷的多种哺乳动物细胞类型兼容。此外，我们还展示了两台仪器之间电穿孔条件的可扩展性。Neon NxT 系统上的基因编辑条件可以扩展到 Xenon 系统，后者是专为符合 GMP 的细胞疗法生产而设计的平台。
Plantamajoside 通过抑制 p38MAPK 和 AKT 磷酸化来调节肺癌的增殖、干细胞和凋亡
植物皂苷（PMS）购自成都慕斯特生物技术有限公司（四川，中国），纯度≥98％。A549、95D、SPC-A1、H460和H292细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。RPMI-1640培养基购自HyClone公司（Cat#SH30809.01；美国犹他州洛根）。胎牛血清（ATCC 30-2020）购自赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州）。二甲基亚砜（DMSO）、1-溴-3-氯丙烷、异丙醇、乙醇、顺铂（DDP）和其他溶剂购自Sigma公司（美国密苏里州圣路易斯）。细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)、0.25%胰蛋白酶、0.01 M PBS (粉末，pH7.2～7.4)、1%多聚甲醛、线粒体膜电位测定试剂盒（含JC-1）和100×青霉素-链霉素溶液均购自北京索莱宝科技有限公司（北京，中国）。B27、表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 均购自 Invitrogen 公司（CA，美国）。一抗，包括抗 Caspas-3 (Cat#ab13847)、抗 Caspas-9 (Cat#ab32539)、抗 SOX2 (Cat#ab93689)、抗 CD44 (Cat#ab216647)、抗
鉴定人类细胞中复制应力反应的关键因素Louise M.E. Janssen 1，Empar Baltasar Perez 1，Chantal Vaartin
方法在补充了10％FCS，1％谷歌补充剂（Gibco），100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素的IMDM（Gibco）中培养了衍生成近单倍型HAP1细胞的细胞培养。siRNA转染是根据制造商的指南使用Rnaimax（Invitrogen）进行的。在这项研究中使用了以下siRNA：Sinon-targetable（Dharmacon），Sipolg2（地平线，TargetPlus，SmartPool），SIMRPL23（Horizon，Targetplus，TargetPlus，Smartpool）。将所有药物（Aphidicolin，Hu，Olaparib，Rad51i（B02），DNA-PKI（NU74441）和寡霉素A）溶解在DMSO中，并以指示浓度使用。细胞使用具有137CS源的γ提取器（最佳疗法）进行γ辐射。生长测定HAP1细胞以1500个细胞/孔的密度将HAP1细胞铺在96孔板中，并被视为5天。5天后，使用100％甲醇固定细胞，并在室温下使用Crystal Violet染色2H。随后，将晶体紫溶解在10％乙酸中，并使用Biotek Epoch Epoch分光光度计在595 nm处测量强度。使用非线性拟合，sigmoidal，4pl，x是log（浓度），将这些测量值用于棱镜中的IC50计算。在9mm玻璃盖上生长免疫荧光细胞，并在室温下以4％甲醛和0.2％Triton X-100固定10分钟。使用了以下抗体：人类抗克雷斯特（Cortex Biochem，CS1058），兔抗PH3SER10（Campro，＃07-081），小鼠抗ERCC6L（PICH）（ABNOVA，ABNOVA，000548421-B01P）。所有初级抗体在4°C的夜间孵育。使用固定缓冲液I（BD生物科学）固定细胞。细胞。二级抗体（分子探针，Invitrogen）和DAPI在室温下孵育2小时。使用延长金（Invitrogen）安装盖玻片。使用具有60倍1.40 Na油目标的Deltavision Deonvolution显微镜（Applied Precision）获取图像。SoftWorx（应用精度），ImageJ，Adobe Photoshop和Illustrator CS6用于处理获得的图像。单倍体插入诱变筛选基因对用APH或HU处理的HAP1细胞的存活至关重要，如先前所述35，使用单倍体插入诱变筛查鉴定。诱变的HAP1细胞是从Brummelkamp实验室获得的。简短地，获得HAP1细胞的诱变如下：在HEK293T细胞中产生了基因陷阱逆转录病毒。每天两次收获逆转录病毒至少三天，并通过离心（使用SW28转子进行2小时，21,000 rpm，4°C，4°C）进行沉淀。在8μg/ml硫酸素硫酸素的存在下，在T175烧瓶中至少连续两天，在8μg/ml硫酸素的存在下，将大约4000万个HAP1细胞通过浓缩基因陷阱病毒的转导而被诱变。在包含10％DMSO和10％FCS的IMDM培养基中冷冻诱变细胞。解冻后，在存在27.5 nm adphidicolin或100μmHu的情况下，将诱变的HAP1细胞转移了10天。传递后，通过胰蛋白酶-EDTA收集细胞，然后进行沉淀。为了最大程度地减少潜在地含有杂合突变的二倍体细胞的混杂，用DAPI染色固定的细胞，以允许使用Astrios Moflo对G1单倍体DNA含量进行分类。将3000万个排序的细胞在56°C下裂解过夜，以使使用DNA迷你试剂盒（QIAGEN）进行基因组DNA分离。插入位点映射基因陷阱插入位点通过LAM-PCR放大，然后进行捕获，ssDNA接头连接和指数放大，并在测序之前使用含有Illumina适配器的引物，如前所述，如前所述35。映射和插入位点的分析以前描述了78。简短地，在对HISEQ 2000或HISEQ 2500（Illumina）进行测序之后，将插入位点映射到人类基因组（H19），允许一个不匹配，并与RefSeq坐标相交，以将插入位点分配给基因。基因区域在相对链上重叠的基因区域没有考虑进行分析，而对于在相同链基因名称上重叠的基因是串联的。对于每种复制和两种药物治疗（APH或HU）基因的必要性都是通过二项式检验确定的。合成致死性。一个基因通过所有Fisher的测试，其p值截止为0.05，效应大小至少为0.12（减法比率wt sense比率 - 复制应力条件感官比率）。
机器的补充信息...
材料。Fmoc-β-amino acids, including Fmoc- L -β-homoalanine, Fmoc- L -β-homoisoleucine, Fmoc- L -β-homoleucine, Fmoc- L -β-homophenylalanine, Fmoc-(1S,2S)-2-aminocyclopentane carboxylic acid, Nβ-Fmoc-Nω-Boc- L -β-homolysine, Fmoc-O-tert-butyl- L -β-homoserine, and Fmoc-α-amino acids, including Fmoc-glycine, Fmoc- L -alanine, Fmoc- L -isoleucine, Fmoc- L - leucine, Fmoc- L -phenylalanine, Fmoc-O-tert-butyl- L -serine, FMOC-L-β-双晶，FMOC-L-主要酸β-TERT-丁基酯，FMOC-L-谷氨酸γ-tert-叔丁基酯，Nα-FMOC-Nε-boc-l-赖氨酸是从Chem-impex International，Inc.（Wood Dale，Inc.，IL，USA，USA，USA）购买的。fmoc-l-脱毛氨酸是从热科学化学品购买的。FMOC-L-Norvaline购自Santa Cruz Biotechnology。hatu是从奥克伍德化学品获得的。Tentagel S RAM FMOC购自Advanced Chemtech（肯塔基州路易斯维尔）。Menadione，N，N-二异丙甲胺，Mueller Hinton肉汤和磷酸二氮的磷酸钠，是从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得的。3-（n-甲磷脂）丙烷磺酸（MOPS）获自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-羧基（XTT）购自从Invitrogen购买。Gibco Brand RPMI 1640粉末（含有苯酚红和L-谷氨酰胺，没有碳酸氢钠或HEPES）和Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPB，无钙或镁）是从Thermo Fisher Scientific（MA）获得的。使用Millipore过滤系统纯化水（18.2MΩ）。细胞滴度GLO 2.0分析套件来自Promega（WI）。
通过一种新型抑制剂的急性髓样白血病
野生型FLT3（FLT3-WT）激酶在未成熟的造血细胞，胎盘，性腺和大脑中表达。1，它在骨髓中造血干细胞的分化和存活中起着重要作用。2在正常的造血环境中，FLT3主要在CD34阳性细胞中表达，并积分参与早期造血，重建多谱系髓样前体，3和树突状细胞成熟。4,5在急性髓样白血病（AML）中，FLT3激酶（FLT3-ITD）的固定结构域（FLT3-ITD）中的内部串联重复，在不同患者的氨基酸序列中显示出最普遍的FLT3 KINAPES突变和大约30-40％的患者的突变。在临床试验中已经研究了许多FLT3激酶抑制剂，例如Gilteritinib，6个crenolanib，7 Quizartinib 8和Midostaurin，9等。然而，当前大多数FLT3激酶抑制剂无法区分结构上类似的CKIT激酶和FLT3-WT激酶，这可能导致骨髓抑制毒性。10在这里，我们报告了一种新型的FLT3-ITD突变体选择性抑制剂CHMFL-FLT3-362（缩写为化合物362）的疾病，该抑制剂在FLT3-WT和CKIT激酶上都具有高选择性。它还针对FLT3- ITD + AML的临床前模型显示出令人印象深刻的体外和体内效率。我们首先使用Z'-Lyte（Invitrogen）生化测定法使用纯化的FLT3 WT/ITD突变蛋白研究了化合物362对FLT3-ITD和FLT3-WT的活性。结合模式的动力学研究表明，化合物362是ATP竞争性抑制剂（图1C）。数据显示，Com-pound 362（有关化学结构的图1A）在FLT3-ITD和FLT3-WT之间的选择性超过30倍（图1B）。然后，我们用一组工程的BAF3细胞测试了化合物362的抗增生效应，这些效果用不同的FLT3 WT/ITD突变体转化（图1D和在线补充表S1）。有趣的是，化合物表现出对所有ITD突变体的有效抑制活性，其长度不同，范围为6至33个氨基酸，并且对FLT3-WT的选择性达到7至30倍。然而，它对包括FLT3-ITD-G697R/D835（DEL/I/V）/Y824（R/H）的FLT3-ITD的耐药突变体的效力要小得多，以及一级功能性突变，包括包括FLT3-ITD-G697R/D835（R/I/V），包括包括FLT3-ITD/D835-ITD-G697R/D835（del/i/v）/Y824（R/h）。所有这些数据都表明化合物362是FLT3- ITD突变体选择性抑制剂。正如预期的那样，这种选择性在白血病细胞系中被选择性抑制对FLT3-ITD依赖性AML细胞（MV4-11，MOLM-13和MOLM-14）与FLT3 WT WT-WT-wt-wt-表达细胞（U937，cmk，oci-AML-2-2，以及HL-2，以及HL-60）的选择性抑制（MV4-11，MOLM-13和MOLM-14）（MOLM-13和MOLM-14）（MOLM-13和MOLM-14）（MOLM-13和MOLM-14）。为了进一步显示com-pount 362的全元组选择性，我们以1 m的浓度对Dovistx的Kinomescan TM技术进行了检查。结果表明，化合物362具有良好的选择性曲线（S得分35 = 0.02）。除了FLT3外，化合物362还显示出与CKIT，CSF1R，FLT1，VEGFR2，PDGFR2，PDGFRα和PDGFRβ激酶的强大结合（图1E和在线补充表S2）。由于激活的TM是一种基于结合的测定法，并且可能不会真正反映激酶的抑制活性，然后我们与Z'-Lyte
16S rRNA ngs粪便细菌菌群的测序...
目标。这项研究的目的是使用16S rRNA基因的下一代测序（NGS）来表征并可能区分健康和肥胖马的下肠道（粪便）细菌。方法。这项研究涉及7匹马（4匹马和3匹母马），年龄8-17岁：乌克兰鞍品种1-4匹马（马1运动马匹rebus，10 Y.O.，马匹2马匹2种马santes，15 Y.O.，15 Y.O.，15 Y.O.），重量吃水的5匹马（种马Tsyhan，8 Y.O.）和非透明马6和7（Mare Sne-Zhynka，10 Y.O.，Mare Rumba 12 Y.O.）马匹2、4、5和7是肥胖，马1、3和6是健康的。所有马匹都保留在州生物技术大学的马术中心，乌克兰教育与科学部（乌克兰哈尔基夫）。根据制造商的说明，使用Purelink微生物组DNAPuriÞ阳离子试剂盒（Invitrogen，USA）提取直肠粪便样品的总DNA。准备了细菌16S rRNA的库，我们使用了16S rRNA条形码试剂盒1-24（美国牛津纳米波尔）。为了净化所获得的库，磁性颗粒核元素清理和尺寸选择（Macherey-Nagel，德国根据推荐的快速测序放大器的建议协议 - 16S条形码（SQK-16SS024）（测序套件的手册）。这些条件基于Fujiyoshi等人（2020）中所述的16S rRNA基因扩增阳离子的标准方案，并确保细菌DNA跨各种群分类群的稳健扩增。结果。结论。细菌门的代表（Syn.肌动杆菌），纤维杆菌，小叶虫 - 螺旋杆菌（Syn.螺旋体），杆菌，富公司（Syn.芽孢杆菌），planctomycetota，verrucomicrobiota（Syn.verrucomicrobia），念珠菌Melainabacteria，kiritimatiellota和proteeobacteria（Syn.假单胞菌）。占主导地位的门是坚硬的，其份额是所有检测到的门的50％至82％。与杆菌的数量相比，健康马匹和肥胖马之间的数量差异很大。在健康马1,3和6中，这是企业和肥胖的马2,4,5和7的2.5、3.4和2.9倍，它是8.6、8.2、7.6和5.7倍。与杆菌相比，坚硬的人数在健康马匹和肥胖马之间发生了显着变化。在健康的马1、3和6中，牢固的数量分别为2.5、3.4和2.9倍，而在肥胖的马2、4、5和7中，牢固的数量分别为8.6、8.2、7.6、7.6和5.7倍。在肥胖的马匹2、4、5和7中观察到蛋白杆菌的数量增加，范围为25％至37％，而在健康运动马1、3和6中，蛋白质的水平在1.07至3.43％之间，这对于健康动物的微生物组典型。在研究的马匹粪便中检测到低水平的放线菌（分杆菌）：健康运动马3分别为0.09％，健康运动马3分别为0.09％，健康马匹6分别为0.15％。相比之下，肥胖的马2、4、5和7的水平分别从0.21％到0.48％。重要的是要注意，放线菌的门还包括BiÞ多杆菌属，在所研究的任何动物中均未检测到。在乌克兰第一次，我们对七个不同年龄，性别和品种的七匹马的下肠道（粪便材料）的细菌菌群进行了测序。在肥胖马的粪便中，细菌的细菌占主导地位（天细菌粉，粉状，裂缝），尤其是来自振荡性螺丝素和lachnospileceae的家族，并伴随着细菌的降低细菌（fcylumberimteroidota）（FC-fcbe）（FC-fc-
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环
解锁OPM-383的潜力：一种新颖的LRRK2 ...
细胞LRRK2激酶活性是使用Invitrogen的Lanthascreen技术测量的。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞用HG2019S或HWT LRRK2转染。 在小鼠成纤维细胞3T3细胞系中测量 LRRK2 PS935/总LRRK2比，以评估LRRK2激酶抑制。 OPM-383报告了细胞IC50值（NM）。 使用辐射蛋白激酶测定（Panqinase®活性测定）来测量所选蛋白激酶面板的激酶活性。 OPM-383溶解在1％DMSO的适当矩阵中。 在细胞色素P450抑制分析中研究了七个主要的细胞色素P450同工型（CYP1A，CYP2B6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4）。 OPM-383溶解在1％Tween 80和1％HPMC中，并通过口服途径给药。 在给药后，在不同时间处死啮齿动物。 使用LC/MS-MS方法对OPM-383进行了定量。 OPM-383（5 µM）脑中的蛋白结合在4H使用UPLVC/MS-MS孵育后进行分析。 在英国Cyprotex评估了体外代谢，渗透性和蛋白质结合的体外代谢。 HERG研究是在Cerep进行的；法国。 OPM-383溶解在1％Tween 80中，1％HPMC溶于水中，并通过口头途径以50 mg/kg的速度进行CD1。 在给药后九十分钟后，迅速剖析了小鼠，并在液氮中迅速解剖血液，脑和肾脏。 用于免疫印迹程序，使用针对PS935和总LRRK2的抗体。 MC-38细胞被接种到C57BL/6小鼠中。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞用HG2019S或HWT LRRK2转染。LRRK2 PS935/总LRRK2比，以评估LRRK2激酶抑制。细胞IC50值（NM）。使用辐射蛋白激酶测定（Panqinase®活性测定）来测量所选蛋白激酶面板的激酶活性。OPM-383溶解在1％DMSO的适当矩阵中。在细胞色素P450抑制分析中研究了七个主要的细胞色素P450同工型（CYP1A，CYP2B6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4）。OPM-383溶解在1％Tween 80和1％HPMC中，并通过口服途径给药。啮齿动物。使用LC/MS-MS方法对OPM-383进行了定量。OPM-383（5 µM）脑中的蛋白结合在4H使用UPLVC/MS-MS孵育后进行分析。在英国Cyprotex评估了体外代谢，渗透性和蛋白质结合的体外代谢。HERG研究是在Cerep进行的；法国。 OPM-383溶解在1％Tween 80中，1％HPMC溶于水中，并通过口头途径以50 mg/kg的速度进行CD1。 在给药后九十分钟后，迅速剖析了小鼠，并在液氮中迅速解剖血液，脑和肾脏。 用于免疫印迹程序，使用针对PS935和总LRRK2的抗体。 MC-38细胞被接种到C57BL/6小鼠中。HERG研究是在Cerep进行的；法国。OPM-383溶解在1％Tween 80中，1％HPMC溶于水中，并通过口头途径以50 mg/kg的速度进行CD1。在给药后九十分钟后，迅速剖析了小鼠，并在液氮中迅速解剖血液，脑和肾脏。用于免疫印迹程序，使用针对PS935和总LRRK2的抗体。MC-38细胞被接种到C57BL/6小鼠中。蛋白质印迹检测和定量，并计算LRRK2 PS935/总LRRK2比例以比较LRRK2激酶抑制剂剂量与媒介物组相比。当肿瘤肿块达到75mm³时，将小鼠随机分配以接受OPM-383（50和100 mg/kg，口服，本次），抗PD1抗体（10 mg/kg，IP，每周两次）或组合。用OPM-383处理通过胃管通过口服烤（PO）进行治疗。给药量为10 mL/kg，调整为最新的个体体重。抗PD-1处理被注入腹膜腔（IP）。 动物治疗35天。 OPM-383使用Sengine-Paris®平台在患者衍生的类器官中进行了评估。 使用声液体处理机器人在第一天对细胞进行处理，不同浓度范围为0.32至10 µm。 在第六天，相对于车辆处理的井，每个孔中的细胞活力是一个百分比确定的。 为了评估药物敏感性，对药物反应曲线的AUC数据进行了分层聚类。 因此，Sengine确定了阈值（SPM），以定义分子在器官中的活性。 如果SPM> 9，则认为类器官对药物敏感，而SPM <9表示耐药性。抗PD-1处理被注入腹膜腔（IP）。动物治疗35天。OPM-383使用Sengine-Paris®平台在患者衍生的类器官中进行了评估。使用声液体处理机器人在第一天对细胞进行处理，不同浓度范围为0.32至10 µm。在第六天，相对于车辆处理的井，每个孔中的细胞活力是一个百分比确定的。为了评估药物敏感性，对药物反应曲线的AUC数据进行了分层聚类。因此，Sengine确定了阈值（SPM），以定义分子在器官中的活性。如果SPM> 9，则认为类器官对药物敏感，而SPM <9表示耐药性。
门户克隆技术
Gateway克隆技术基于保守和定向的重组系统，该系统允许在不同的克隆向量之间传递DNA片段，从而保持阅读网格，而无需核苷酸或损失。使用这种技术，不再需要使用限制性核酸内切酶（消除使用限制酶固有的任何限制）和DNA连接酶[1]。与传统的克隆方法相比，这项技术更快，更高效且便宜。此技术使您可以获得极高的克隆效率（大于90％）[2]。该技术是蛋白质合成和功能分析的极好克隆方法[3]。通过两种反应，BP和LR反应，使用了Gateway克隆机制（在ATTP和ATTB，ATTL和ATTR之间）利用gateway的克隆机制。为了发生BP反应，我们首先在包括ATTB序列的引物对[1.3]（供体载体包括ATTP位置[1]）的帮助下放大了感兴趣的基因。包括ATTB位置的PCR产品与包括ATTP位置的供体矢量相结合，从而形成了输入克隆[1]。ATTB和ATTP位置之间的这种整合反应在于该反应的起源，这引起了含有attl两侧的感兴趣基因的入口克隆（由ATTB和ATTP的重组组成）[1]。LR反应是进入克隆ATTL位置与目标向量的ATTT位置之间的重组反应，导致表达克隆[3]。从BP反应获得的输入克隆包括ATTL位置，目标向量构建以包括ATTR [1]位置。LR反应旨在将感兴趣的基因转移到目标载体，因此输入克隆与适当的目标矢量和LR克隆酶混合。这些地方之间的重组产生了两个分子[2]，其中一个包含感兴趣的DNA段，另一个分子是一个副产品，其中包含CCDB基因，该基因与大肠杆菌DNA干扰了它的生长，以阻止其生长[3]。 CCDB。该基因对该技术非常重要，因为它可以防止大肠杆菌生长，从而允许进行负面选择。也就是说，在这两种反应中重组后，我们将拥有一种产品（将具有CCDB基因所在的感兴趣的基因）和副产品（将具有感兴趣基因所在的CCDB基因），因此，当选择的菌落将在其中包含一个具有利益的载体的菌落时，可以更轻松地（将其更容易）（可以选择一个是表达和表达的基因）使网关克隆技术成为高性能克隆技术的因素）。要获得包含CCDB基因的载体和传播向量，我们必须求助于e.coli db3.1 striber，该基因在Girase DNA中具有突变（gyra462），使其对该基因的致命作用具有抗性[3]。将感兴趣的基因或DNA片段克隆在输入克隆中后，我们可以将其转移到各种目的地向量，从表达蛋白到大肠杆菌细胞，酵母，昆虫，哺乳动物之间[4]。该方法的一些主要应用是这样的事实，即它允许输入向量向他人的亚克隆，基于攻城特异性重组，允许每个亚键反应以维持适当的阅读网格，速度和易于次数。