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naomi A. fineberg a,b, * * * * * * * * e M. M. M. Mench ́ On D,Natalie Hall,Bernard Dell'Osso,G,H,H,I,Matthias Brand the Baptist,Blesseds的Joes of Blesseds,Solo DeTrivis,T,Hans St. Daniel L. King Daniel L. Beatrice Benatti F,G,Maca Pellegrini A,Dario Conti,F,Ilaria M. Riva AV,Gianluigi M. Riva AV,但Flayelle Ax,Thomas Hall和Josephnaomi A. fineberg a,b, * * * * * * * * e M. M. M. Mench ́ On D,Natalie Hall,Bernard Dell'Osso,G,H,H,I,Matthias Brand the Baptist,Blesseds的Joes of Blesseds,Solo DeTrivis,T,Hans St. Daniel L. King Daniel L.Beatrice Benatti F,G,Maca Pellegrini A,Dario Conti,F,Ilaria M. Riva AV,Gianluigi M. Riva AV,但Flayelle Ax,Thomas Hall和Joseph
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摘要:CRISPR-Cas9 正在彻底改变我们开展科学研究、治疗疾病和开发新作物的方式。这种基因组编辑技术的广泛影响使得本科生了解和使用这种新工具至关重要。在本文中,我们描述了一个为期数周的实验室模块,该模块教本科生如何设计 CRISPR-Cas9 构建体并筛选 CRISPR 修饰的基因型。该模块通过独立研究的视角进行;学生进行基因型筛选以寻找新的敲除突变。在我们的模块中,学生筛选玉米幼苗中的 MAD2 基因突变,这有助于我们正在进行的减数分裂染色体分离研究。该模块可以调整以敲除任何生物体中的任何基因,从而与教师的研究计划保持一致。参与原创研究有助于本科生在实验室中培养独立性和主动性以及 CRISPR-Cas9 的分子技术。关键词:CRISPR-Cas9、sgRNA、载体、基因型筛选 简介 革命性的基因组编辑技术 CRISPR-Cas9 正在改变我们的世界,为科学研究、医学和农业提供新工具。CRISPR-Cas9 的先驱者最近因其影响而获得诺贝尔奖(Ioannidis 等人,2020 年)。CRISPR 的强大之处在于它的精确度;与之前的技术不同,CRISPR 能够在基因组中的特定位置直接编辑遗传密码。凭借这种精确度,科学家可以删除、插入或修改任何生物体中的任何基因。这种强大的工具现已成为科学实验分子工具包中的标准工具(Adli,2018 年)。对于考虑从事生物科学职业的学生来说,使用 CRISPR 的能力至关重要。但是,了解这项技术可以让所有学生,无论职业道路如何,参与有关其道德用途的知情讨论。本文介绍了一个为期 5-6 周的实验室模块,通过让本科生参与一个新的研究项目来教他们如何使用 CRISPR。该模块分为五个单元,每个单元可以在一个 2-3 小时的实验部分中完成(表 1)。
1。Lamb AN,Rosenfeld JA,Neill NJ等。 在12p12.1时Sox5的单倍不足与具有明显的行为延迟,行为问题和轻度畸形特征的发育延迟有关。 嗡嗡声突变。 2012; 33:728-740。 2。 Aza-Carmona M,Shears DJ,Yuste-Checa P等。 shox与软骨的转录因子Sox5和Sox6相互作用,以使Aggrecan增强剂作用。 hum mol Genet。 2011; 20:1547-1559。 3。 Harley VR,Clarkson MJ,Argentaro A. 睾丸确定因子的分子作用和调节,SRY(Y染色体上的性别确定区域)和Sox9 [与SRY相关的高弹性组(HMG)Box 9]。 Endocr Rev。 2003; 24:466-487。 4。 Truebestein L,Leonard TA。 盘绕螺旋:长而短。 生物评估。 2016; 38:903-916。 5。 Ikeda T,Zhang J,Chano T等。 识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。 基因。 2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。Lamb AN,Rosenfeld JA,Neill NJ等。在12p12.1时Sox5的单倍不足与具有明显的行为延迟,行为问题和轻度畸形特征的发育延迟有关。嗡嗡声突变。2012; 33:728-740。2。Aza-Carmona M,Shears DJ,Yuste-Checa P等。shox与软骨的转录因子Sox5和Sox6相互作用,以使Aggrecan增强剂作用。hum mol Genet。2011; 20:1547-1559。3。Harley VR,Clarkson MJ,Argentaro A. 睾丸确定因子的分子作用和调节,SRY(Y染色体上的性别确定区域)和Sox9 [与SRY相关的高弹性组(HMG)Box 9]。 Endocr Rev。 2003; 24:466-487。 4。 Truebestein L,Leonard TA。 盘绕螺旋:长而短。 生物评估。 2016; 38:903-916。 5。 Ikeda T,Zhang J,Chano T等。 识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。 基因。 2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。Harley VR,Clarkson MJ,Argentaro A.睾丸确定因子的分子作用和调节,SRY(Y染色体上的性别确定区域)和Sox9 [与SRY相关的高弹性组(HMG)Box 9]。Endocr Rev。2003; 24:466-487。 4。 Truebestein L,Leonard TA。 盘绕螺旋:长而短。 生物评估。 2016; 38:903-916。 5。 Ikeda T,Zhang J,Chano T等。 识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。 基因。 2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。2003; 24:466-487。4。Truebestein L,Leonard TA。盘绕螺旋:长而短。生物评估。2016; 38:903-916。 5。 Ikeda T,Zhang J,Chano T等。 识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。 基因。 2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。2016; 38:903-916。5。Ikeda T,Zhang J,Chano T等。 识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。 基因。 2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。Ikeda T,Zhang J,Chano T等。识别和表征人类长的SOX5(L-SOX5)基因。基因。2002; 298:59-68。 6。 Wu L,Yang Z,Dai G等。 SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。 Acta Biochim Biophys罪。 2022; 54:987-998。 7。 Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。2002; 298:59-68。6。Wu L,Yang Z,Dai G等。SOX5通过调节膀胱癌的DNMT1/P21途径来促进细胞的生长和迁移。Acta Biochim Biophys罪。2022; 54:987-998。7。Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。 SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。 Proc Natl Acad Sci u s a。 2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。Kwan KY,Lam MM,Krsnik Z等。SOX5在森林中进行了森林,迁移,迁移后分化以及子板和深层新皮质神经元的投影。Proc Natl Acad Sci u s a。2008; 105:16021-16026。 8。 神经元。2008; 105:16021-16026。8。神经元。Lai T,Jabaudon,BJ和Al。 SOX5皮质果神经元神经元的依次属。 2008; 57:232-247。 9。 Martin-Mors PL,AC女王,倒钩,道德AV。 sox5按照wnt-beta诱导的途径符合这种新进展的这种进展。 REP。 2010; 11:466-4 10。 问题交流,Stolt CC,Coral R和Al。 neu-robiol必须 2015; 75:522-538。 11。 li,menine menendize c,garci-corse l和al。 我们需要新的成年干细胞操作。 rep眼。 2022; 38:1 12。 Edgerley K,Bryson L,Hanington L和Al。 SOX5:综合征Shaffer进一步消耗了进一步的扩展现象。 am j with genet a 2023; 191:1447-1458。 13。 扬声器M,Na和Al。 变体解释使用人群数据:第一GMMAD。 Mutat的Hum 2022; 43:1012-1 14。 Rentzsch P,Schubma M,Shendure J,Kirker M. Cadd-Splicity-Splicity-Splicity-Splicity-Splicity-Splicity-Splicity the Genome vide变体变体预测,使用传递深度分数。 基因组医学。 2021; 13:31。 15。 ioannidis NM,Rothstein JH,Pejaver V和Al。 reve:变体的致病性。 am j hum genet 2016; 99:877-885。Lai T,Jabaudon,BJ和Al。SOX5皮质果神经元神经元的依次属。2008; 57:232-247。 9。 Martin-Mors PL,AC女王,倒钩,道德AV。 sox5按照wnt-beta诱导的途径符合这种新进展的这种进展。 REP。 2010; 11:466-4 10。 问题交流,Stolt CC,Coral R和Al。 neu-robiol必须 2015; 75:522-538。 11。 li,menine menendize c,garci-corse l和al。 我们需要新的成年干细胞操作。 rep眼。 2022; 38:1 12。 Edgerley K,Bryson L,Hanington L和Al。 SOX5:综合征Shaffer进一步消耗了进一步的扩展现象。 am j with genet a 2023; 191:1447-1458。 13。 扬声器M,Na和Al。 变体解释使用人群数据:第一GMMAD。 Mutat的Hum 2022; 43:1012-1 14。 Rentzsch P,Schubma M,Shendure J,Kirker M. 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Katrin Amunts 1,2,Markus Axer 1,3,Swati Banerjee 4,Lise Bitsch 5,Jan G. Bjaalie 6,Philipp Brauner 7,Andrea Brovelli 8,Navona Calarco 9,Navona Calarco 9,Marcel Carrere 3,8,8,Sven Casper 1 1,Sven Cine Cine,Sven Cine,Sven jcine jcine 1,1,1 1,1,12。 IO UGO D'Angelo 16,Giulia de Bonis 17,Gustavo Deco 18,19,Javier Defelipe 20,21,Alain Destexhe 22,Timo Dickscheid,Mark,23,EmrahDüzel,23,EmrahDüzel25,26,27,Simon B. Eickhoff 28,29,Gaute 28,29,Gaute Einevoll 30,kek Athinka Evers 35,Nataliia Fedorchenko 2,Phanie J. Stekel,36,D。Fous。 AG 47,I Sater 49,I Sabine。 Ver 5,Alois C. Knoll 60,Zeljka Krsnik 61,JuliaKämpfer1,Matthew E Larkum 62,Marja-Leena Linne 63,Thomas Lippert 59,Jafri Malin Abdullah 46 66,Jorge Mejias 67,Andreas Meyer-Lindenberg 68,Michele Migliore 69,Judith Michael 7,Yannick Morel 70,Fabrice O. Morin 60,Lars Muck Ogels,177,73,Nicola Palomero-Gallagher 1,2 Et M. Peeters 76,Spase Petkoski 37,Nicolai Petkov 7 7,Lucy S. Petro 7 7,Petro A. 9,Giovanni Pezzulo 80,Pieter Roelfsema 55,81,82,83 Maria V. Sanchez-Vives 18.94,Johannes Schemmel 77,Walter Senn 78,Alexandra A. de Sousa 95.96,FelixStröckens2,Bertrand Thirion 97,Kamil Uluda 9.52 ,Lisa Vincenz-Donnelly 1,Florian Walter 104,Laszlo Zaborszky 105
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卡特里斯(Katris)amunts 1:2,马克斯·轴(Markus Axer)1:3,Swati Banerjee 4,虱子5,Jan G. Bjaalie 6,Philip Brauner 7,Andrea Brovelli 8,Ven Cichon 1,12,13,Mann 24,7 Ismaphairus Abd Hamid 46,Herold Claus C. Hilgetag的Chrina 47,48,7,56,Gregory,Kiar 57,Zeljka 58,Lars Clus T 58,Jafri Malin Abdul Lah 46,Paola di Magielse 76 Itter 86,凯瑟琳·罗克兰88,斯特凡·鹿特89,安德烈亚斯·罗德90,萨宾·鲁兰德·伯特兰·蒂里恩,伯特兰97,伯特兰9.52,伯特兰9.52,ncenz-donnelly,弗洛里安·沃尔特104
O. Grulke 1,25,,∗,C.Albert 2,J.A。K. Aleynikova 1 , AL Alonnikova 3 , G. Anda 4 , T. Andreeva 1 , M. Arvanitou 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1,E。Ascasibar3 3 5 5,48 4,J.-P。是Bähner6,S.-G。 Baek 6,M。Balden7,JBosch 1,10,H。Bouvain 1,St. Bride 1,T。错误1,H。Braune 1,C。 Büschel1,R。Bussiahn1,A。Bus4,B。12,D。Casta Coenen 11,G。Conway7,M。Cornelissen1,27,Y。Corre14,P。 这座城堡7,G。Csymic11,H。Grandfather1,R.J。 Davies 1,C。第16天,S。Discover 1,R。of Wolf 17,W。Decker 17,A。Despontin 9,P。Despontin 15,C.P。 Dhard 1,A。Dinkle 1,18,F.A。 ISA 19,T。 首先22,F.J。Escot 3,M.S。 特殊1,10,T。Strawberry 3,D。Fehling 8,L。Feuerstein 16,J。Fellinger 1,Y。Felg 1,D.L.C。 Fernand 7,St.Fisher 1,E.R。 O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。Bosch 1,10,H。Bouvain 1,St. Bride 1,T。错误1,H。Braune 1,C。Büschel1,R。Bussiahn1,A。Bus4,B。12,D。CastaCoenen 11,G。Conway7,M。Cornelissen1,27,Y。Corre14,P。 这座城堡7,G。Csymic11,H。Grandfather1,R.J。 Davies 1,C。第16天,S。Discover 1,R。of Wolf 17,W。Decker 17,A。Despontin 9,P。Despontin 15,C.P。 Dhard 1,A。Dinkle 1,18,F.A。 ISA 19,T。 首先22,F.J。Escot 3,M.S。 特殊1,10,T。Strawberry 3,D。Fehling 8,L。Feuerstein 16,J。Fellinger 1,Y。Felg 1,D.L.C。 Fernand 7,St.Fisher 1,E.R。 O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。Coenen 11,G。Conway7,M。Cornelissen1,27,Y。Corre14,P。这座城堡7,G。Csymic11,H。Grandfather1,R.J。 Davies 1,C。第16天,S。Discover 1,R。of Wolf 17,W。Decker 17,A。Despontin 9,P。Despontin 15,C.P。Dhard 1,A。Dinkle 1,18,F.A。ISA 19,T。首先22,F.J。Escot 3,M.S。 特殊1,10,T。Strawberry 3,D。Fehling 8,L。Feuerstein 16,J。Fellinger 1,Y。Felg 1,D.L.C。 Fernand 7,St.Fisher 1,E.R。 O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。首先22,F.J。Escot 3,M.S。特殊1,10,T。Strawberry 3,D。Fehling 8,L。Feuerstein 16,J。Fellinger 1,Y。Felg 1,D.L.C。Fernand 7,St.Fisher 1,E.R。 O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。Fernand 7,St.Fisher 1,E.R。O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。O. Kazakov 15,N。Essice 28,W。Kernbichler 2,A.K。Flom 9,O。Ford1,T。Fornal 23,J。Frank 1,10,9,G。García-Rega Grahl 1,H。Green 7,E。Grigore 50,M。Cruise 23,J.F。García-Rega Grahl 1,H。Green 7,E。Grigore 50,M。Cruise 23,J.F。战争Arnaiz 1,V。Haak1,L。VanHam 1,K。Hammond26,B。Momstra27,X。Han 9,S.K。 Hansen 6,Harris 8,D。Hartmann 1,D,K。Hophler 7,St.Hoermann 7,42,K.-P。所有第51,A。Holtz 1,D。应该11,M。Houry 14,J。Huang 11,M。Hubeny 11,K。Hunger 7,D。Hwangbo 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45,K。Ida,Z Jouna,Z Jouna 15,St.-Stair 30,J.-P。 Kamionka 1,W。Caspare49,C。Cawan11,Ye。 Kharwandikar 1,M。Khokhlov1,C Klepper 8,T。Klinger1,18,J.Knauer 1,A。Knieps 11,M Cortual 27,J。Koschinsky 1,J CRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。 Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,战争Arnaiz 1,V。Haak1,L。VanHam 1,K。Hammond26,B。Momstra27,X。Han 9,S.K。Hansen 6,Harris 8,D。Hartmann 1,D,K。Hophler 7,St.Hoermann 7,42,K.-P。所有第51,A。Holtz 1,D。应该11,M。Houry 14,J。Huang 11,M。Hubeny 11,K。Hunger 7,D。Hwangbo 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45,K。Ida,Z Jouna,Z Jouna 15,St.-Stair 30,J.-P。 Kamionka 1,W。Caspare49,C。Cawan11,Ye。 Kharwandikar 1,M。Khokhlov1,C Klepper 8,T。Klinger1,18,J.Knauer 1,A。Knieps 11,M Cortual 27,J。Koschinsky 1,J CRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。 Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,Hansen 6,Harris 8,D。Hartmann 1,D,K。Hophler 7,St.Hoermann 7,42,K.-P。所有第51,A。Holtz 1,D。应该11,M。Houry 14,J。Huang 11,M。Hubeny 11,K。Hunger 7,D。Hwangbo 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45,K。Ida,Z Jouna,Z Jouna 15,St.-Stair 30,J.-P。 Kamionka 1,W。Caspare49,C。Cawan11,Ye。Kharwandikar 1,M。Khokhlov1,C Klepper 8,T。Klinger1,18,J.Knauer 1,A。Knieps 11,M Cortual 27,J。Koschinsky 1,J CRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。 Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,Kharwandikar 1,M。Khokhlov1,CKlepper 8,T。Klinger1,18,J.Knauer 1,A。Knieps 11,M Cortual 27,J。Koschinsky 1,J CRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。 Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,Klepper 8,T。Klinger1,18,J.Knauer 1,A。Knieps 11,M Cortual 27,J。Koschinsky 1,JCRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。 Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,CRUTD 22,M。Krychowiak1,I。Kubkowska23,M.D。Laqua 1,18,M.R。 Larsen 25,Laqua 1,18,M.R。Larsen 25,Larsen 25,Cuczy 1,D。Klalla1,A。Kumar34,T。Kurki-Suonio 32,I。Kawk35,S。Kwak1,V。Lancetti15,A。Langenberg1,H。Laqua1,H.P。