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非模型酵母的代谢工程Issatchenkia Orientalis SD108用于5-氨基乙酸生产
多年来，摘要5-氨基乙烯酸（5- ALA）的生物产生受到了人们的关注。但是，由于产生5 -ALA，发酵汤将变得酸性，因此在5 -ALA生物合成和细胞生长之间存在权衡。为了解决这一限制，我们设计了一种耐酸的酵母，即Issatchenkia Orientalis sd108，以进行5 -ALA生产。我们首先发现I. Orientalis SD108的细胞生长速率被5 -ALA增强，其内源性ALA合成酶（ALA）的活性高于其他酵母中的同源物。通过优化质粒设计，过表达转运蛋白和增加基因拷贝数，将5- ALA的滴度从28 mg/L到120-，150-和300 mg/L的提高。使用丙酮酸脱羧酶（PDC）敲除菌株（SD108δPDC）并用尿素进行培养后，我们将510 mg/l的滴度提高到510 mg/l，13-折叠率增强性，证明了与新的IOIALAL活动的重要性，我们将510 mg/l的滴度提高到510 mg/l，这是13-倍数增强。这项研究证明了耐酸I. OrientalisSD108ΔPDC在将来大规模的5- ALA产生的潜力很高。
Fatma 等人，2023 年。“东方伊萨酵母中用于多拷贝基因整合的着陆垫系统。”代谢工程。DOI：10.1016/j.ymben.202
方法 • 开发了生物信息学流程来识别和确定全基因组基因间整合位点的优先顺序，并筛选了引导 RNA（gRNA）切割效率、基因盒整合效率、由此产生的细胞适应性和 GFP 表达水平的位点，• 构建了着陆垫系统以实现在一轮转化中多个基因或基因的多拷贝的整合，• 通过整合多个拷贝的 5-氨基乙酰丙酸合酶来产生 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和使用单个 gRNA 产生琥珀酸的生物合成途径，在 I. orientalis 中展示了该系统。
东方伊萨酵母多拷贝基因整合的着陆垫系统
非传统酵母东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis) 的强健特性使其能够在高酸性条件下生长，因此，人们对使用多种碳源生产有机酸的兴趣日益浓厚。最近，东方伊萨酵母的遗传工具箱的开发，包括附加型质粒、多个启动子和终止子的特征以及 CRISPR-Cas9 工具，简化了东方伊萨酵母的代谢工程工作。然而，由于缺乏有效的多拷贝整合工具，多重工程仍然受到阻碍。为了促进通过多重 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑构建大型复杂代谢途径，我们开发了一条生物信息学流程来识别和确定全基因组基因间位点的优先级，并表征了位于 21 个基因间区域的 47 个 gRNA。对这些位点进行了向导 RNA 切割效率、基因盒的整合效率、由此产生的细胞适应度和 GFP 表达水平的筛选。我们进一步利用来自这些已充分表征的基因座的组件开发了一种着陆垫系统，该系统可帮助利用单个引导 RNA 和用户选择的多个修复模板整合多个基因。我们已经证明了利用着陆垫同时将 2、3、4 或 5 个基因整合到目标基因座中，效率超过 80%。作为概念验证，我们展示了如何通过一步整合多个位点的五个基因拷贝来提高 5-氨基乙酰丙酸的产量。我们进一步证明了该工具的效率，即利用单个引导 RNA 和五个不同的修复模板整合五个基因表达盒，构建了琥珀酸生产代谢途径，从而在批量发酵中生产出 9 g/L 的琥珀酸。这项研究证明了单个 gRNA 介导的 CRISPR 平台在非传统酵母中构建复杂代谢途径的有效性。该着陆垫系统将成为 I. orientalis 代谢工程的宝贵工具。
Issatchenkia Orientalis
图1。SD108中全基因组整合位点的硅筛选算法算法。 （a）用于ICAS9介导的整合的基因基因座中的GRNA。 扫描基因组以获取“ NGG” PAM以获得指南RNA库。 筛选GRNA以最大程度地减少潜在的脱靶，并根据其基因组位置过滤。 （b）纳入各种因素以优先考虑基因组基因局进行实验筛查。 GRNA及其相应的同源臂是根据寡核苷酸合成和质粒克隆标准来完善的。 设计规则是通过避免调节元素的破坏和包括基因本质信息的中断来确保应变稳定性的，而基因密度则是添加基因密度作为开放染色质的代理。 转录组数据纳入了接近转录活性基因的选择位置。算法。（a）用于ICAS9介导的整合的基因基因座中的GRNA。扫描基因组以获取“ NGG” PAM以获得指南RNA库。筛选GRNA以最大程度地减少潜在的脱靶，并根据其基因组位置过滤。（b）纳入各种因素以优先考虑基因组基因局进行实验筛查。GRNA及其相应的同源臂是根据寡核苷酸合成和质粒克隆标准来完善的。设计规则是通过避免调节元素的破坏和包括基因本质信息的中断来确保应变稳定性的，而基因密度则是添加基因密度作为开放染色质的代理。转录组数据纳入了接近转录活性基因的选择位置。
非模型酵母东方伊萨酵母 SD108 的基因组规模代谢重建及其在有机酸生产中的应用
许多平台化学品可以由微生物从可再生生物质中生产，其中有机酸占很大一部分。然而，对由此产生的低 pH 生长条件的不耐受仍然是微生物工业化生产有机酸的挑战。Issatchenkia orientalis SD108 是一种很有前途的工业化生产宿主，因为它可以耐受低至 pH 2.0 的酸性条件。为了系统地评估这种非模型酵母的代谢能力，我们为 I. orientalis SD108 开发了一个基因组规模的代谢模型，涵盖 850 个基因、1826 个反应和 1702 种代谢物。为了改进模型的定量预测，通过实验确定并实施了生物体特定的大分子组成和 ATP 维持要求。我们检查了它的网络拓扑结构，包括必需基因和通量耦合分析，并与酿酒酵母的 Yeast 8.3 模型进行了比较。我们探索了碳底物的利用，并检查了生物体生产工业相关琥珀酸的潜力，利用 OptKnock 框架来识别将目标化学物质的生产与生物质生产结合起来的基因敲除。基因组规模代谢模型 iIsor 850 是一个数据支持的精选模型，可以为过度生产的基因干预提供信息。