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儿童软组织肉瘤的 CRISP(Y) 未来
从 Jinek 等人（2012、2013）和 Qi 等人（2013）的工作开始，原核生物用于防御外源病毒的自适应系统——成簇的规律间隔回文重复序列 (CRISPR) 与 CRISPR 相关核酸内切酶 9 (Cas9) 配对，越来越多地被认可为一种强大而有效的基因组编辑工具。RNA 引导的 CRISPR/Cas9 由一条小的引导 RNA (sgRNA) 与 Cas9 复合而成，它与目标 DNA 配对会诱导单个 Cas9 依赖的双链断裂 (DSB)（由 Lino 等人，2018 年综述）。由此产生的编辑包括在活细胞基因组的特定目标区域删除或插入特定序列，或改变预先存在的 DNA 序列（图 1）。近期，该技术已得到丰富，可用于标记 DNA 区域（Banito 等人，2018 年）、调节内源基因表达（La Russa 和 Qi，2015 年）或改变表观遗传状态（Vojta 等人，2016 年）。与转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和锌指核酸酶 (ZFN) 技术相比，CRISPR/Cas9 允许进行多重分析，构建速度快且更易于递送，编辑效率更高，即使脱靶切割更频繁（Gupta 和 Musunuru，2014 年）。在过去十年中，这种方法已经进入了癌细胞存活、转移和耐药性的基础和临床前肿瘤学研究领域。在这篇小型评论中，我们将概述 CRISPR/Cas9 技术，特别关注其在揭示致瘤机制和确定一组易位阳性儿童软组织肉瘤 (STS) 中可能针对的途径中的应用。
基因组编辑
1）山本2018 2）Jinek M，Chylinski K，Fonfara I等。适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA内切酶。Science，337（6096）：816-821，2012 3）Nishimasu H，Shi X，Ishiguro S等。工程CRISPR-CAS9核酸酶，具有扩展的靶向空间。Science，361（6408）：1259-1262，2018 4）RAN FA，HSU PD，LIN CY等。通过RNA引导的CRISPR CAS9进行双重划痕，以增强基因组编辑特异性。Cell，154（6）：1380-1389，2013 5）Vakulskas CA，Dever DP，Rettig GR等。作为核糖核蛋白复合物传递的高保真CAS9突变体可以在人造血茎和祖细胞中有效地编辑。nat Med。24（8），1216-1224，2018 6）Suzuki K，Tsunekawa Y，Hernandez-Benitez R等。通过CRISPR/CAS9介导的同源性靶向整合进行体内基因组编辑。 自然，540（7631）：144-149，2016 7）Sakuma T，Nakade S，Sakane Y等。 使用Talens和CRISPR-CAS9与音高系统进行 MMEJ辅助基因敲入。 自然方案，11（1），118–133，2016 8）Sakuma T，Nishikawa A，Kume S等，使用多合一的CRISPR/CAS9矢量系统在人类细胞中的多重基因组工程。 科学报告，4：5400，2014）Nishida K，Arazoe T，Yachie N等。 使用杂种p ro kar yotic yotic and d ver teb速率自适应IM MU N E系统进行靶向核苷酸编辑。 Science，353（6305）：AAF8729，2016 10）Anzalone AV，Randolph PB，Davis JR等。 搜索和重新定位基因组编辑通过CRISPR/CAS9介导的同源性靶向整合进行体内基因组编辑。自然，540（7631）：144-149，2016 7）Sakuma T，Nakade S，Sakane Y等。MMEJ辅助基因敲入。自然方案，11（1），118–133，2016 8）Sakuma T，Nishikawa A，Kume S等，使用多合一的CRISPR/CAS9矢量系统在人类细胞中的多重基因组工程。科学报告，4：5400，2014）Nishida K，Arazoe T，Yachie N等。使用杂种p ro kar yotic yotic and d ver teb速率自适应IM MU N E系统进行靶向核苷酸编辑。Science，353（6305）：AAF8729，2016 10）Anzalone AV，Randolph PB，Davis JR等。搜索和重新定位基因组编辑
基因编辑及其应用的最新进展
基因编辑领域的最新进展为植物生物学研究提供了前所未有的工具，为改良现有作物和从头驯化新作物提供了无限的潜力。本期《基因编辑及其应用》焦点问题介绍了基因编辑领域的最新技术创新，解决了在基础和应用植物生物学研究中使用该技术所面临的挑战，并提供了该领域未来发展的观点。本期焦点问题包含 9 篇由基因编辑子领域专家深入撰写的更新，16 篇研究论文重点介绍了最近的技术突破或基因编辑在解决生物学问题和/或改良作物中的应用。在本文中，我们首先总结了开发新型基因编辑试剂、将试剂递送到植物细胞中、大规模分析编辑事件和去除转基因方面取得的进展。然后，我们讨论了实现各种类型基因修饰的最新进展，包括点突变、基因打靶 (GT)、染色体工程和表观遗传修饰。此外，我们利用本期焦点问题中提供的例子，重点介绍了使用 CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）介导的基因编辑在作物改良和从头驯化中的研究。可编程核酸酶是基因组编辑领域爆炸式增长的核心。CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9)（Jinek 等人，2012 年）和 Cas12a（Zetsche 等人，2015 年）核酸酶及其衍生物是基因编辑中使用最广泛的核酸酶。然而，细菌和古细菌中存在许多多样且未开发的 CRISPR-Cas 系统，它们为扩展我们的植物基因编辑工具箱提供了巨大潜力（Burstein 等人，2017 年）。新的 CRISPR–Cas 系统可能使我们能够克服原间隔区相邻基序序列、靶标特异性和 Cas9 的蛋白质大小的限制。新的核酸酶还可以潜在地降低育种许可成本
基因组编辑技术及未来发展
[1] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. 混合限制性内切酶：锌指融合至 Fok I 切割域。美国国家科学院院刊，1996，93：1156-60 [2] Boch J, Scholze H, Schornack S 等人。破解 TAL 型 III 效应物的 DNA 结合特异性密码。科学，2009，326：1509-12 [3] Moscou MJ, Bogdanove AJ。一个简单的密码控制 TAL 效应物的 DNA 识别。科学，2009，326：1501 [4] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I 等人。适应性细菌免疫中的可编程双 RNA 引导 DNA 内切酶。 Science, 2012, 337:816-21 [5] Wyman C, Kanaar R. DNA双链断裂修复：结局好一切都好。Annu Rev Genet, 2006, 40:363-83 [6] Komor AC, Kim YB, Packer MS等人。无需双链DNA切割即可对基因组DNA中的目标碱基进行可编程编辑。Nature, 2016, 533:420-4 [7] Nishida K, Arazoe T, Yachie N等人。利用混合原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑。Science, 2016, 353:8729 [8] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA等人。无需DNA切割即可对基因组DNA中的A*T进行可编程碱基编辑为G*C。 Nature, 2017, 551: 464-71 [9] Kurt IC, Zhou R, Iyer S, et al. CRISPR C-to-G 碱基编辑器用于诱导人类细胞中的靶向 DNA 颠换。Nat Biotechnol, 2021, 39: 41-6 [10] Zhao D, Li J, Li S, et al. 糖基化酶碱基编辑器可实现 C-to-A 和 C-to-G 碱基变化。Nat Biotechnol, 2021, 39: 35-40 [11] Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. 搜索和
基因编辑技术的监管和治理（...
“基因编辑”描述了分子生物学中的一系列工具和技术，使科学家能够对任何生物体的遗传物质进行定向改变。基因编辑可以被理解为一种“门户技术”；这些技术为实验环境提供了多功能、易用的工具，并且在各个领域都有着广泛的潜在应用。修改 DNA 的技术自 20 世纪 70 年代就已开始使用，而早期的基因编辑技术则出现于大约 30 年前。然而，直到 2012 年 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 领导的研究小组发现了 CRISPR/cas9 基因编辑（Jinek 等人，2012 年），才引发了全球对基因编辑的兴趣和活动的激增。CRISPR 是成簇随机散布的短回文重复序列的缩写，与其他基因改造或基因编辑工具相比，它的作用更快、更便宜，也更容易制造和使用。大多数学术和商业生命科学实验室都具备使用 CRISPR 所需的技能和设备，而且 CRISPR 组件也通过现有的生物试剂分销渠道以低成本迅速供应（Martin 等人，2020 年）。此前 40 多年的基因工程技术研究和商业活动也有助于确定大量的应用范围或提出新的发展途径，CRISPR 可能会在这些方面改进现有的基因改造实践。因此，从出版物数量（Asquer 和 Krachkovskaya，2021 年；Zhou 等人，2021 年）和专利申请数量（Bicudo 等人，2022 年）来看，全球基因编辑研究自 2012 年以来急剧增加。基因编辑从一个小众研究兴趣，现在必须被视为一个国际科学、商业和日益受到公众关注的领域（Martin 等人，2020 年）。正如如今新兴技术领域（我们可能想到人工智能或纳米技术）的普遍情况一样，CRISPR/cas9 基因编辑在大众媒体和科学媒体中都被视为前景广阔（Ledford，2015；Maben，2016）。基因编辑可应用于几乎所有生物体，从植物到
CRISPR/Cas基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的临床 ...
[1] Egger G，Liang G，Aparicio A等。人类疾病的表观遗传学和表观遗传疗法的前景。 自然，2004，429：457-63 [2] Varmus H.为基于基因的药物做好准备。 New Engl J Med，2002，347：1526-7 [3] Pogue RE，Cavalcanti DP，Shanker S等。 罕见的遗传疾病：诊断，治疗和在线资源的更新。 Div> Discov今天，2018年，23：187-95 [4] Fischer A，Cavazzana-Calvo M.遗传疾病的基因治疗。 Lancet，2008，371：2044-7 [5] Porteus M.基因组编辑：一种新的人类治疗方法。 Annu Rev Pharmacol Toxicol，2016，56：163-90 [6] Cox DBT，Platt RJ，ZhangF。治疗基因组编辑：前景和挑战。 nat Med，2015，21：121-31 [7] Barrangou R，Fremaux C，Deveau H等。 crispr提供了对原核生物中病毒的抗药性。 Science，2007，315：1709-12 [8] Deltcheva E，Chylinski K，Sharma CM等。 CRISPR RNA通过反式编码的小RNA和宿主因子RNase III成熟。 自然，2011，471：602-7 [9] Cong L，Ran FA，Cox D等。 使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程。 Science，2013，339：819-23 [10] Jinek M，Chylinski K，Fonfara I等。 适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA内切酶。 Science，2012，337：816-21 [11] Maruyama T，Dougan SK，Truttmann MC等。 通过抑制非同源末端连接来提高精确基因组编辑的效率。 nat Biotechnol，2015，33：538-42 [12] Shmakov S，Smargon A，Scott D等。 快照：2类CRISPR-CAS系统。人类疾病的表观遗传学和表观遗传疗法的前景。自然，2004，429：457-63 [2] Varmus H.为基于基因的药物做好准备。New Engl J Med，2002，347：1526-7 [3] Pogue RE，Cavalcanti DP，Shanker S等。罕见的遗传疾病：诊断，治疗和在线资源的更新。Div> Discov今天，2018年，23：187-95 [4] Fischer A，Cavazzana-Calvo M.遗传疾病的基因治疗。Lancet，2008，371：2044-7 [5] Porteus M.基因组编辑：一种新的人类治疗方法。Annu Rev Pharmacol Toxicol，2016，56：163-90 [6] Cox DBT，Platt RJ，ZhangF。治疗基因组编辑：前景和挑战。nat Med，2015，21：121-31 [7] Barrangou R，Fremaux C，Deveau H等。crispr提供了对原核生物中病毒的抗药性。Science，2007，315：1709-12 [8] Deltcheva E，Chylinski K，Sharma CM等。CRISPR RNA通过反式编码的小RNA和宿主因子RNase III成熟。自然，2011，471：602-7 [9] Cong L，Ran FA，Cox D等。使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程。Science，2013，339：819-23 [10] Jinek M，Chylinski K，Fonfara I等。适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA内切酶。Science，2012，337：816-21 [11] Maruyama T，Dougan SK，Truttmann MC等。通过抑制非同源末端连接来提高精确基因组编辑的效率。nat Biotechnol，2015，33：538-42 [12] Shmakov S，Smargon A，Scott D等。快照：2类CRISPR-CAS系统。2类CRISPR-CAS系统的多样性和演变。Nat Rev Microbiol，2017，15：169-82 [13] Makarova KS，Zhang F，Koonin EV。Cell，2017，168：328-328.e1 [14] Zetsche B，Gootenberg JS，Abudayyeh Oo等。CPF1是2类CRISPR- CAS系统的单个RNA引导的内切酶。 Cell，2015，163：759-71 [15] Ran Fa，Cong L，Yan WX等。 使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑。 自然，2015，520：186-91 [16] Kim E，Koo T，Park SW等。 在体内基因组编辑中，带有弯曲杆菌的小Cas9直系同源CPF1是2类CRISPR- CAS系统的单个RNA引导的内切酶。Cell，2015，163：759-71 [15] Ran Fa，Cong L，Yan WX等。使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑。 自然，2015，520：186-91 [16] Kim E，Koo T，Park SW等。 在体内基因组编辑中，带有弯曲杆菌的小Cas9直系同源使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑。自然，2015，520：186-91 [16] Kim E，Koo T，Park SW等。在体内基因组编辑中，带有弯曲杆菌的小Cas9直系同源在体内基因组编辑中，带有弯曲杆菌的小Cas9直系同源
社论埃及杂志《农业研究基因工程》是CRISPR/CASPR/CAS基因组编辑技术的植物育种的未来吗？
摘要CRISPR/CAS基于创新的繁殖技术现在为植物育种者提供了前所未有的机会，可以产生遗传变异的繁殖。由于CRISPR/CASPR/CASGENOME编辑的最新进展，能够有效地靶向大多数作物变化的能力表明，农业进步可能会加快。关键字：CRISPR/CAS9，基因组编辑，植物育种，小麦，大米，基因编辑（GE）Technology CRISPR/CAS（定期散布的短篇小说重复/CRISPR相关蛋白），通常被称为“遗传剪刀”，该公司于11年前首次发表，该公司在Emmanielle anderna eylna eylna（Jenn eylna）（遗传剪刀）首次发表（ ）。如果认真对待道德问题，那么在治疗应用处于最前沿的许多领域中，CRISPR/CAS技术的应用可能是革命性的。div> div> div> div> div> div> div> div> div> div> div> div> DOUDNA和CHARPENTIER于2020年因开发促进“重写生命守则”的技术的重大贡献而获得了诺贝尔化学奖。crispr/cas9目前是植物基因组最常见的编辑系统（Invens等，2022），这是因为它仅需要通用CAS9核酸酶的表达和一个（或更多）单个指南RNA（SGRNA）（SGRNA），该指南（SGRNA）专门设计以使其与某些靶基因序列相匹配，从而使其与某些dna相匹配。我们所生活的时代以全球人口前所未有的增长率为标志。目前估计的世界人口为77亿，到2030年预计到2030年，到2050年将飙升至88亿（Bhatta and Malla，2020年）。这一挑战引发了人们对更高量的食物（约50％）的不愉快需求，这对当前有限的农业生产率施加了巨大负担。气候变化通过升高大气温度，增加干旱并增加土壤盐度来加剧这种情况，所有这些都降低了全球农业生产力并威胁粮食安全（Hazman等，2022）。此外，发现气候变化使植物更容易受到害虫和病原体的影响，这显着对作物产量和质量产生了负面影响（Kim等，2022）。因此，弥合此差距的最有效策略是每个土地面积单位（例如，英亩）提高生产力。
转录激活的神经元细胞类型工程
诱导的所需基因表达一直是揭示基因功能和调节合成生物学和治疗应用的细胞活性的重要策略。Apart from ectopically expressing additional copies of a gene by introducing their open reading frames (ORFs), methods to arti fi cially activate endogenous copies of genes have been explored, including transcription activating factors tethered to zinc fi nger proteins ( Beerli et al., 2000 ) and transcription activator-like effectors (TALE) ( Miller et al., 2011 ; Zhang et al., 2011 ; Maeder等人，2013b； Perez-Pinera等，2013b）。Originally discovered as a virus-resistance mechanism from bacteria ( Barrangou et al., 2007 ), the CRISPR-Cas system has provided ef fi cient, precise, and scalable ways to modulate expression of genes, and has been successfully adopted for targeted gene activation ( Mali et al., 2013 ; Perez-Pinera et al., 2013a ; Maeder et al., 2013a ; Cheng et al., 2013年，Tanenbaum等人，2014年；为了使用CRISPR-CAS9实现基因激活，创建了催化失活的Cas9（DCAS9），以与特定的基因组区域结合而没有能力创建双链突破（Jinek et al。，2012; Gasiunas et al。，2012; Qi et al。，2013; Qi et al。，2013; Konermann et; Konermann et al an al an eal; konermann et al。，2013; a e e，2013; i。赋予DCAS9具有诱导基因表达的能力，已经探索了不同的转录激活域的基因激活强度（图1A）。第一代CRISPRA的灵感来自锌纤维和基于故事的方法，并使用了包括VP64或P65在内的单个激活域。vp64由VP16的四个副本组成，该副本是源自单纯疱疹病毒的转录激活因子。p65是NF-κB复合物的一部分，负责免疫信号传导中的转录激活。第二代CRISPRA系统制定了不同的策略来招募不同的激活剂的多个副本，包括用于招募10或24份VP64副本的Suntag阵列到给定的基因座，VP64，P65和RTA（VPR）的串联融合到DCAS9，以及
基于CRISPR/Cas9 的激活系统研究进展
816–821。[11] Lowder L，Malzahn A，Qi YP. Rapid evolution of manifold CRISPR systems for plant gene editing. Front Plant Sci, 2016, 7: 1683。[12] Maeder ML，Linder SJ，Cascio VM，等。CRISPR RNA引导的内源性人类基因激活。Nat Methods, 2013, 10(10): 977-979。[13] Lindhout BI，Pinas JE，Hooykaas PJJ，等。利用锌指人工转录因子文库筛选拟南芥同源重组突变体。Plant J, 2006, 48(3): 475-483。[14] Liu WS，Rudis MR，Peng YH，等。合成TAL效应物用于靶向增强植物转基因表达。Plant Biotechnol J，2014，12(4):436-446。[15] Qi LS、Larson MH、Gilbert LA等。将CRISPR重新用作RNA引导平台，用于序列特异性控制基因表达。Cell，2013，152(5):1173-1183。[16] Chylinski K、Le Rhun A、Charpentier E。II型CRISPR-Cas免疫系统的tracrRNA和Cas9家族。RNA Biol，2013，10(5):726-737。[17] Nishimasu H、Cong L、Yan WX等。金黄色葡萄球菌Cas9的晶体结构。Cell，2015，162(5):1113-1126。 [18] Jinek M, Jiang FG, Taylor DW 等. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated configuration activity. Science, 2014, 343(6176): 1247997。[19] Anders C, Niewoehner O, Duerst A 等. Structural basis of PAM-dependent target DNA identification by the Cas9 endonuclease. Nature, 2014, 513(7519): 569-573。[20] Wang Y, Zhang ZT, Seo SO 等. Gene transcription repression in Clostridium beijerinckii using CRISPR-dCas9. Biotechnol Bioeng, 2016, 113(12): 2739-2743。[21] Bikard D, Jiang WY, Samai P 等.利用工程化的 CRISPR-Cas 系统可编程地抑制和激活细菌基因表达。Nucleic Acids Res，2013，41(15)：7429-7437。[22] Didovyk A、Borek B、Tsimring L 等人。利用 CRISPR-Cas9 进行转录调控：原理、进展和应用。Curr Opin Biotechnol，2016，40：177-184。[23] Li ZX、Xiong XY、Li JF。工作死物：将失活的 CRISPR 相关核酸酶重新用作植物中的可编程转录调节剂。aBIOTECH，2020，1(1)：32-40。[24] Piatek A、Ali Z、Baazim H 等人。RNA 引导的
精准基因组编辑技术与应用
CRISPR/Cas 系统，特别是 CRISPR/Cas9（Jinek 等人，2012；Cong 等人，2013），已被开发为一个强大而多功能的平台，用于操作各种物种的基因组。近年来，许多报告表明其在人类基因治疗和生命科学研究以及动植物育种方面具有强大的潜在应用。本研究主题“精准基因组编辑技术和应用”中的集合可能就是明证。通常，CRISPR/Cas9 核酸酶用于切割目标基因组 DNA 以产生位点特异性双链断裂 (DSB)，主要通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，或在较小程度上通过同源定向修复 (HDR) 修复。经典的 NHEJ 修复途径可产生小的插入或缺失 (indel)，通过在开放阅读框 (ORF) 中引入移码导致目标编码基因的功能丧失。NHEJ 诱变是一种非常流行的基因操作策略。除了经典的 NHEJ 之外，替代或准确的 NHEJ 介导的修复可以实现精确的基因组 DNA 缺失（Guo et al., 2018; Shou et al., 2018）。Chao 等人和 Zhao 等人在本研究主题中的两篇论文分别描述了等位基因特异性敲除和双基因敲除小鼠模型的制造，用于快速疾病基因验证和人类异种移植研究。N6-甲基腺苷 (m6A) 是一种成熟的真核 mRNA 表观遗传修饰。越来越多的研究发现了 m6A 甲基化的意义，这催生了“表观转录组学”这一新兴领域。本卷中的另一篇文章（ Huang 等人）描述了小鼠精原细胞 GC-1 细胞中脂肪质量和肥胖相关（ Fto ）基因的敲除研究，该基因已被证明作为 m6A 去甲基化酶作用于表观转录组（ Li 等人，2017 年； Lin 等人，2017 年）。另一方面，HDR 修复途径依赖于同源供体 DNA 在 DSB 位点产生靶向基因敲入或在两个 DSB 位点之间产生基因替换。精确的点突变和设计的小插入/缺失也可以通过这种方法实现。本专题中的一篇论文介绍了利用CRISPR/Cas9介导的HDR在人诱导性多能干细胞（iPSC）中精准校正Rett综合征（RTT）中甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因的努力。该报道为基于iPSC的疾病建模和基因校正治疗提供了参考（Le等）。虽然基于HDR的基因组可以实现基因插入和精准替换，但在精准编辑过程中仍面临一些缺点，包括HDR效率低、双等位基因靶向失败、正向选择的复杂性以及选择标记的重新删除。