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TCR 敲除 Jurkat 细胞系
描述 TCR 敲除 Jurkat 细胞系是通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑生成的，以去除 TCRα 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）结构域。背景 T 细胞受体 (TCR) 位于 T 细胞表面，负责识别与 MHC（主要组织相容性复合体）分子结合的抗原。TCR 的参与会启动下游 NFAT 信号传导，从而导致 T 细胞活化。TCR 由两种不同蛋白质链的异二聚体组成，其中 alpha（α）和 beta（β）链是主要链。CRISPR/Cas9 基因组编辑用于去除 α 和 β 链的 TRAC（T 细胞受体 Alpha 常数）和 TRBC1（T 细胞受体 β 常数 1）区域，导致 TCR 表达丧失。应用 在生成或表征 CAR-T 细胞时用作对照 提供的材料
CRISPR敲入协议 - 用于Jurkat细胞...
注意：确保将Cas9蛋白添加为反应中的最后材料。在KO的情况下，无需添加HDRT。表中Cas9与SGRNA的比率为1：3，对于1.8kb dsDNA，HDR为1μg。强烈建议每种特定设计对CAS9的实验优化：SGRNA比和Cas9蛋白和HDRT的量。Genscript建议通过测试1：1至1：4之间的RNP比率开始优化。我们建议最初可以将DsDNA的量设置在0.5μg和3μg之间（对于0.5kb和4KB之间的HDRT；如果HDRT长度超过此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。为第一个实验分别设置负面对照，阳性对照和转染控制是最好的做法。
质子泵抑制剂（PPIS）的Jurkat T淋巴细胞凋亡诱导
凋亡（通常称为程序性细胞死亡）不断发生在人类中。随着癌细胞的酸度增加，诱发了凋亡。在健康细胞中，质子泵蛋白允许H +离子渗透到细胞膜，从而调节pH值。然而，质子泵抑制剂（PPI），例如奥美拉唑，防止质子运动，导致pH调节。在先前的研究中，奥美拉唑诱导了Jurkat T淋巴细胞的细胞死亡；但是，尚无证实细胞是通过细胞凋亡或通过坏死而死亡的，而细胞爆发。通过使用膜联蛋白-V染色，可以测量奥美拉唑，右氯唑唑和埃索美吡唑对凋亡诱导的影响。细胞死亡。右兰索拉唑和埃索美拉唑在18小时时均达到100％的凋亡，表明它们具有较早的凋亡激活点。为了测量细胞活力的程度，通过用小钙蛋白 - 乙酰氧基甲基（AM）染料染色细胞来测量胞质酯酶活性。Jurkat细胞暴露于Omeprazole，Dexlansoprazole和Esomeprazole六个小时，并监测30小时以测量生存能力。阿霉素是一种已知的化学治疗性，在测试凋亡诱导和生存力时也被用作阳性对照。使用荧光显微镜成像时，由于膜联蛋白V-FITC的结合而导致凋亡荧光的任何细胞以及由于PI的结合而导致的坏死细胞荧光。用钙软蛋白AM（如果细胞荧光，它们）被认为是可行的，而非荧光细胞被认为是坏死的。在30小时的标记下，右倾角唑的生存力最小（40.0±3.5％的细胞可行），其次是阿霉素（62.9±1.8％），埃索美普唑（66.2±1.6％）和欧洲普拉唑（69.29±2.01％）（69.29±2.01％），在比较（71％）中（71％）（71％）。右兰索拉唑的生存能力低，表明需要使用相同的PPI和暴露方法进行毒性研究，以确定最佳药物浓度。奥美拉唑和埃索美瑞唑的最佳浓度为1 µm，右兰索拉唑啉为0.5 µm。未来的研究包括使用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染料在确定浓度下测试细胞死亡方法。
使用 5Z-7- 抑制 MAP2K7-JNK 通路...
补充图 4：用 0.45 μM（JURKAT）和 0.72 μM（P12-ICHIKAWA）5Z7O 孵育 48 小时的 JURKAT 和 P12-ICHIWAKA 细胞的 DNA 含量分析。碘化丙啶 (PI) 染色的流式细胞术分析。
优先考虑十一-十九种白血病抑制剂作为治疗急性髓系白血病的潜在候选药物
图 4. 72 小时 ENL 抑制剂处理后，(a) MOLM-13 (b) MV4-11 (c) Jurkat 和 (d) HEK293T 细胞的存活率。(e) 72 小时抑制剂 13 处理后，MOLM-13、MV4-11、Jurkat 和 HEK293T 细胞的细胞存活率比较。(f) MOLM-13 (g) MV4-11 和 (h) Jurkat 细胞在 10 µM ENL 抑制剂作用下的增殖。(i) 在指定温度下，用 10 μM (+) 或 DMSO (-) 中的 13 处理的 MOLM-13 (顶部) 和 MV4-11 (底部) 细胞中的 CETSA。β-肌动蛋白用作上样对照。用 13 或 DMSO 阴性对照处理的 (j) MOLM-13 和 (k) MV4-11 细胞中 HOXA9、MEIS1、MYB 和 MYC 基因表达的 qRT-PCR 分析。 *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。不显著 (ns) P > 0.05。
细胞周期调节蛋白 p21CIP1/WAF1 是细胞致死性扩张所必需的
摘要：放线菌伴生细胞致死性膨胀毒素 (Cdt) 可诱导淋巴细胞发生细胞周期停滞和凋亡；毒性取决于活性 Cdt 亚基 CdtB。我们现在证明，p21 CIP1 / WAF1 对 Cdt 诱导的细胞凋亡至关重要。Cdt 可诱导淋巴细胞系 Jurkat 和 MyLa 以及原代人类淋巴细胞中 p21 CIP1 / WAF1 水平升高。这些增加取决于 CdtB 作为磷脂酰肌醇 (PI) 3,4,5-三磷酸 (PIP3) 磷酸酶发挥作用的能力。值得注意的是，Cdt 诱导的 p21 CIP1 / WAF1 水平升高伴随着磷酸化 p21 CIP1 / WAF1 水平的显著下降。通过双管齐下的方法来防止这些变化，评估了 Cdt 诱导的 p21 CIP1 / WAF1 增加的重要性；与新型 p21 CIP1 / WAF1 抑制剂 UC2288 预孵育，并使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) / cas9 基因编辑开发 p21 CIP1 / WAF1 缺陷细胞系 (Jurkat p21 − )。UC2288 阻断了毒素诱导的 p21 CIP1 / WAF1 增加，用这种抑制剂处理的 Jurkat WT 细胞对 Cdt 诱导的细胞凋亡的敏感性降低。同样，Jurkat p21 − 细胞未能发生毒素诱导的细胞凋亡。通过证明 Cdt 诱导的促凋亡蛋白 Bid、Bax 和 Bak 水平的增加依赖于 p21 CIP1 / WAF1，进一步证实了 Cdt、p21 CIP1 / WAF1 和细胞凋亡之间的联系，因为这些变化在 Jurkat p21 − 细胞中没有观察到。最后，我们确定 p21 CIP1 / WAF1 的增加依赖于毒素诱导的伴侣热休克蛋白 (HSP) 90 水平和活性的增加。我们提出 p21 CIP1 / WAF1 在介导 Cdt 诱导的毒性中起着关键的促凋亡作用。
有效地递送活性Cas9蛋白和靶标特异性SGRNA到广泛的细胞类型
最后，在悬浮液中生长的Jurkat细胞中，评估了吉赛克的敲除生理相关的内源基因。敲除靶向的CD81，该CD81编码在许多哺乳动物细胞中表达的细胞表面蛋白，并与丙型肝炎，HIV和流感发病机理有关。jurkat细胞用Cas9和CD81特异性SGRNA的表达质粒共转染，或用靶向CD81的Cas9 -Sgrna RNP复合物预加载的gesiles处理。通过抗体标记评估CD81的基因敲除效率，然后进行流式细胞仪分析（图4）。基于质粒的递送导致效率非常低。只有7％的细胞损失CD81表达。相反，吉塞拉（Gesicles）具有很高的效率，其中76％的Jurkat细胞缺乏可检测到的CD81水平。因此，吉质的表现优于基于质粒的技术，具有在难以转化细胞中有效靶向内源基因的能力。
测量治疗抗体的定量测定...
图3。左上角：ADCC生物测定原则的插图。右上：在ADCC生物测定效应子Jurkat细胞系中FcγRIIIIA-F158过表达的流式细胞仪分析（F变体； BPS Bioscience＃60540）。左下：在表达HER2 SKBR-3乳腺癌细胞的情况下，ADCC对抗HER2抗体药物曲妥珠单抗反应。右下：在SKBR-3和FcγRIIIIA-F158/NFAT荧光素酶报告基因jurkat细胞（EC50 = 28.1 ng/ml）的共同培养中，ADCC对增加剂量的曲妥珠单抗的反应。用biorender.com创建的插图。
产品信息
它使用Jurkat T细胞（两者IC 50 = 0.05 µM）抑制记者测定中的NF-κB-和AP-1介导的转录，并且在Jurkat T细胞中抑制了IL-2和IL-8水平（两者IC 50 = 0.03 µm）。SP100030（每天20 mg/kg持续三天）可将嗜酸性粒细胞和T细胞浸润成支气管肺泡灌洗液（BALF），并降低卵巢蛋白 - 敏感性大鼠ASTHMA模型中分离的肺组织中AP-1和磷酸化的AP-1水平。2，它以每天每天1 mg/kg的剂量给药时，可防止骨骼肌，棕色脂肪组织，脾脏，肾脏和心脏肿块减少。3 SP100030（每天10 mg/kg）抑制博来霉素诱导的体重降低，湿干性肺重量比增加，并增加肺蛋白质蛋白质，脊髓过氧化物酶（MPO），弹性酶，胶原蛋白酶，胶原蛋白和IL-1β水平的肺纤维纤维纤维纤维纤维纤维化小鼠模型中的IL-1β水平。4
Alt-R HDR 设计工具和 HDR 供体寡核苷酸
图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 （A）供体寡核苷酸修改的示意图。 （B）每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统（Lonza）将四个靶向基因位点的 RNP 复合物（2 µM）与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3，以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸：未经任何修饰的寡核苷酸（未修饰的）、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸（PS 修饰的）和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸（Alt-R HDR 修饰的）。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。