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World File Search SystemKT2440
野生型 KT2440 与基因组的比较......
假单胞菌 KT2440 是一种强大的芳香分解代谢细菌，已被广泛改造用于将生物基和废物基原料转化为目标产品。为了对假单胞菌 KT2440 进行工业化驯化，之前已经进行了合理的基因组减少，从而产生了假单胞菌菌株 EM42，该菌株表现出可能对生产菌株有利的特征。在这里，我们比较了假单胞菌 KT2440 和 EM42 衍生菌株从芳香族化合物对香豆酸和在单独的菌株中从葡萄糖生产顺式、顺式-粘康酸的情况。令我们惊讶的是，EM42 衍生菌株在从任何一种底物生产粘康酸方面的表现并不优于 KT2440 衍生菌株。在生物反应器培养中，KT2440 和 EM42 衍生菌株分别以 45 g/L 和 37 g/L 的滴度从对香豆酸产生粘康酸，并以 20 g/L 和 13 g/L 的滴度从葡萄糖产生粘康酸。为了进一步了解亲本菌株之间的差异，我们分析了 KT2440 和 EM42 在芳香族化合物作为唯一碳源和能源时的生长情况。总体而言，EM42 菌株的生长速度比 KT2440 菌株低，但生长滞后时间更短。我们还观察到，与 KT2440 衍生菌株相比，EM42 衍生菌株在葡萄糖上的生长速度更高，但仅限于测试的最低葡萄糖浓度。转录组学显示，EM42 中的基因组减少对转录水平具有整体影响，并表明从葡萄糖产生粘康酸的 EM42 衍生菌株在响应葡萄糖浓度变化时表现出基因表达调节降低。总体而言，我们的研究结果表明，有必要进行进一步研究来了解基因组减少对微生物代谢和生理的影响，特别是当用于生产菌株时。
建立一个直接的I-SCEI介导的重组一个质粒系统，用于在P. p. putida KT2440中进行有效的基因组编辑
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证。是根据作者/资助者提供的预印本（未经Peer Review的认证）提供的，他已授予Biorxiv的许可证，以在2024年1月23日发布的此版本中在版权所有者中显示预印本。 https://doi.org/10.1101/2024.01.23.576838 doi：Biorxiv Preprint
具有异型的全细胞筛选方法
由于其直接电子传输到电极的能力，稀土金属作为辅因子的利用及其周质定位，吡咯烷二酚奎诺酮依赖性的醇dehydroge- nases（pqqq-adhs）代表了一类有趣的生物催化剂，用于各种生物技术应用程序。对于大多数生物催化剂而言，蛋白质稳定性是库的，要么在给定的过程条件下提高蛋白质的性能，要么最大程度地提高蛋白质对突变操纵的鲁棒性，通常需要增强或引入感兴趣的功能。在这项研究中，我们描述了一个全细胞筛选测定法，适用于探测Escherichia Coli BL21（DE3）细胞中的PQQ-ADH活动，并使用此测定法筛选智能突变库，以提高PQQ-ADH PEDE的热稳定性（PP_2674）（PP_2674）（ppseudomonas putida putida ktida KT22440）。在连续三轮筛选时，我们确定了三个不同的氨基酸位置，这显着改善了酶的稳定性。The subsequent combination of the bene fi cial mutations fi nally results in the triple mutant R91D/ E408P/N410K, which not only exhibits a 7 ° C increase in thermal stability but also a twofold increase in residual activity upon incubation with up to 50% dimethyl sulfoxide (DMSO), while showing no signi fi - cant difference in enzymatic ef fi ciency ( k cat / k m）。
通过锰锌介导的自氧化
通过催化木质素去聚物的产生芳香单体的努力在历史上一直集中在芳基 - 醚键裂解上。然而，木质素中很大一部分的芳族单体与各种碳 - 碳（C - C）键相连，这些碳（C - C）键更具挑战性地裂解和限制木质素去聚合物的芳族单体产量。在这里，我们报告了一种催化自氧化方法，以从木质素衍生的二聚体和松树和杨树中的低聚物中裂解C - C键。该方法将锰和锌硅盐用作乙酸中的催化剂，并产生芳香族羧酸作为主要产物。在工程化的假单胞菌putida kt2440的菌株中，将含氧单体的混合物有效地转化为顺式 - 核酸，该菌株在4位时进行芳族O-二甲基化反应。这项工作表明，使用MN和ZR的木质素自氧化提供了一种催化策略，以提高木质素的宝贵芳族单体的产量。
一个多功能的托管病毒衍生的纳米颗粒，其靶向癌细胞并内化为
随着合成生物学的努力变得更加雄心勃勃，活细胞中预定义功能的工程需要越来越准确的工具。此外，遗传构建体的表型性能的表征需要细致的测量和广泛的数据获取，以实现进食数学模型和沿设计构建测试生命周期的匹配预测。在这里，我们开发了一种遗传工具，可以简化高通量转座子插入测序（TNSEQ）：携带HIMAR1 Mariner Transposase System的PBLAM1-X质粒载体。这些质粒源自Mini-TN5转座子矢量PBAMD1-2，并按照标准欧洲矢量体系结构（SEVA）格式的模块化标准构建。为了展示它们的功能，我们分析了60个土壤假单胞菌putida kt2440克隆的测序结果。新的PBLAM1-X工具已经包含在最新的SEVA数据库版本中，在这里我们使用实验室自动化工作流程描述其性能。
用于高通量筛选的标准化转座子工具
随着合成生物学研究的规模越来越大，在活细胞中设计预定义功能需要越来越精确的工具。此外，遗传构建体表型性能的表征需要细致的测量和广泛的数据采集，以便在设计-构建-测试生命周期中为数学模型提供信息并匹配预测。在这里，我们开发了一种简化高通量转座子插入测序 (TnSeq) 的遗传工具：携带 Himar1 Mariner 转座酶系统的 pBLAM1-x 质粒载体。这些质粒源自 mini-Tn5 转座子载体 pBAMD1- 2，并按照标准欧洲载体结构 (SEVA) 格式的模块化标准构建。为了展示它们的功能，我们分析了 60 个土壤细菌 Pseudomonas putida KT2440 克隆的测序结果。新的 pBLAM1-x 工具已经包含在最新的 SEVA 数据库版本中，我们在这里使用实验室自动化工作流程描述了它的性能。
代谢工程通讯
假单胞菌 KT2440 是一种研究较为深入的细菌，可将木质素衍生的芳香族化合物转化为生物产品。假单胞菌中先进遗传工具的开发缩短了假设检验的周转时间，并使得能够构建能够生产各种目标产品的菌株成为可能。在这里，我们评估了可诱导 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 工具集对荧光、必需和代谢靶标的作用。结果表明，用阿拉伯糖 (8K) 诱导启动子表达的核酸酶缺陷型 Cas9 (dCas9) 在各种培养基条件下以及靶向必需基因时均受到严格调控。除了批量生长数据外，还进行了单细胞延时显微镜检查，结果显示同克隆群体中敲低率的内在异质性。在指数增长的细胞中，研究了跨基因组靶标的敲低动力学，发现诱导后普遍存在 1.75 ± 0.38 小时的静止期，其中发生 1.5 ± 0.35 次倍增后才会观察到表型反应。为了展示这套 CRISPRi 工具集的应用，β-酮己二酸（一种性能优越的尼龙单体）以 4.39 ± 0.5 g/L 的浓度和 0.76 ± 0.10 mol/mol 的产量从对香豆酸（一种可从禾本科植物中提取的羟基肉桂酸）中生产出来。这些培养指标是通过使用更高强度的 IPTG (1K) 诱导启动子在指数期早期敲低 β KA 途径中的 pcaIJ 操纵子来实现的。这使得大部分碳被分流到所需产品中，同时无需补充碳和能量来源来支持生长和维持。