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使用 CRISPR/Cas9 进行 CBLB 消融可增强人类胎盘干细胞衍生 NK 细胞的细胞毒性，用于癌症免疫治疗
摘要 背景 肿瘤通常会对内源性免疫细胞（包括自然杀伤 (NK) 细胞）的监视产生抗性。离体激活和/或扩增的 NK 细胞对各种肿瘤细胞均具有细胞毒性，是过继性癌症免疫治疗的有前途的疗法。基因改造可以进一步增强 NK 效应细胞活性或活化敏化。在这里，我们评估了泛素连接酶 Casitas B 系淋巴瘤原癌基因-b (CBLB)（一种淋巴细胞活性的负调节剂）的基因缺失对胎盘 CD34 + 细胞来源的 NK (PNK) 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的影响。方法利用 CRISPR/Cas9 技术在胎盘来源的 CD34 + 造血干细胞中敲除 CBLB，然后分化为 PNK 细胞。在体外表征了细胞扩增、表型和对肿瘤细胞的细胞毒性。在 NOD-scid IL2R gamma 缺失 (NSG) 小鼠的急性髓系白血病 (HL-60) 肿瘤模型中测试了 CBLB 敲除 (KO) PNK 细胞的抗肿瘤功效。评估了 PNK 细胞的持久性、生物分布、增殖、表型和抗肿瘤活性。结果使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术实现了 94% 的 CBLB KO 功效。CBLB KO 胎盘 CD34 + 细胞分化为 PNK 细胞，细胞产量高，纯度 >90%（由 CD56 + CD3 − 细胞身份决定）。CBLB 消融不会影响细胞增殖、NK 细胞分化或 PNK 细胞的表型特征。与未修饰的 PNK 对照相比，CBLB KO PNK 细胞在体外对一系列液体和实体肿瘤细胞系表现出更高的细胞毒性。 CBLB KO PNK 细胞输注到经白消安处理的 NSG 小鼠体内后，表现出体内增殖和成熟，表现为 3 周内 CD16、杀伤性免疫球蛋白样受体和 NKG2A 表达增加。此外，与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB KO PNK 细胞在播散性 HL60-荧光素酶小鼠模型中表现出更高的抗肿瘤活性。结论与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB 消融增强了 PNK 细胞效应功能和增殖能力。这些数据表明，靶向 CBLB 可能通过增强 NK 细胞疗法的抗肿瘤活性提供治疗优势。
CRISPR/Cas9 介导的 EZH2 敲除抑制了……
摘要：三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性极强的乳腺癌亚型，具有肿瘤内异质性的特点，与其他类型的乳腺癌相比，TNBC更易发生侵袭和转移。本研究旨在探讨腺病毒介导的成簇调控间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统是否能够有效靶向TNBC细胞中的zeste增强子同源物2（EZH2），为CRISPR/Cas9系统用于乳腺癌的基因治疗奠定实验基础。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具在MDA-MB-231细胞中敲除EZH2，建立EZH2敲除（KO）组（EZH2-KO组），另设GFP敲除组（对照组）和空白组（Blank组）。通过T7 内切酶I（T7EI）酶切、mRNA检测及Western印迹实验验证载体构建及EZH2-KO成功。通过MTT、划痕实验、Transwell及体内肿瘤生物学实验检测基因编辑后MDA‑MB‑231细胞增殖及迁移能力的变化。mRNA及蛋白检测结果显示，EZH2‑KO组EZH2的mRNA及蛋白表达均明显下调。EZH2 mRNA及蛋白表达的差异在EZH2‑KO组中有所体现。
微生物传感器ELMO1和NOD2之间的串扰形状肠道免疫反应
抽象的微生物传感器在维持细胞同构体中起着至关重要的作用。我们的知识仅限于微生物感测如何帮助差异免疫反应及其与炎症保守病的联系。最近我们已经证实，胞质溶胶中存在的ELMO1（吞噬和细胞运动蛋白-1）参与病原体感应，吞噬和肠炎。在这里，我们表明ELMO1与另一个传感器NOD2（含核苷酸结合寡聚结构域2）相互作用，该蛋白2识别细菌细胞壁成分Muramyl二肽（MDP）。NOD2的多态性与克罗恩病（CD）发病机理有关。有趣的是，我们发现ELMO1和突变体Nod2（L1007F）的过表达无法清除与CD相关的粘附侵入性大肠杆菌（AIEC -LF82）。使用ELMO1和NOD2 KO小鼠的肠源性单层（EDMS）评估ELMO1-NOD2相互作用在上皮细胞中的功能意义。随后，我们还评估了ELMO1或NOD2或两者两者耗尽的J774巨噬细胞中的免疫反应。用AIEC -LF82的鼠EDM感染在ELMO1 -KO，NOD2 KO EDMS和ELMO1 KO EDMS中显示出更高的细菌载荷，并用NOD2抑制剂处理。鼠巨噬细胞细胞表明，ELMO1和NOD2的下调与细菌清除受损有关，细菌清除率与减少促炎性细胞因子和活性氧相关。我们的结果表明，肠道感染和炎症性疾病中微生物传感器之间的串扰影响细菌负荷和疾病发病机理的命运。
rivaroxaban是一种直接口服因子XA抑制剂，通过减轻Xa-par2介导的自噬抑制
0.05（n¼3）。所有数据均表示为平均值的平均标准误差。（b）从蛋白酶激活的受体2（PAR2）基因敲除（KO）和
基于串联引导 RNA 的高效 CRISPR 策略...
摘要 基于 CRISPR/Cas9 的基因敲除 (KO) 能够精确扰动人类细胞中的靶基因功能，理想情况下可以通过分子组学读数以无偏的方式进行评估。通常，这需要漫长的分离 KO 亚克隆的过程。我们在此表明，无论使用哪种向导 RNA，KO 亚克隆在表型上都是异质的。我们提出了一种实验策略，该策略可避免亚克隆并实现细胞池中快速有效的基因沉默，该策略基于两个向导 RNA 的协同组合，这些向导 RNA 位于基因组接近处（40-300 bp）。我们的策略可实现更可预测的插入/缺失生成，具有较低的等位基因异质性，同时残留靶蛋白表达较低或不可检测，这由 MS3 质谱蛋白质组学确定。我们的方法适用于非分裂原代细胞，也可用于研究必需基因。它能够生成仅反映目标消融表型的高置信度组学数据。
孤雌生殖竹节虫的开创性基因组编辑
竹节虫 Medauroidea extradentata 的孤雌生殖生命周期为转基因品系的产生提供了独特的优势，因为原则上在第一代就可以实现同源且稳定的转基因品系。然而，到目前为止，用于操纵其基因的遗传工具尚未开发出来。在这里，我们成功地实施了 CRISPR/Cas9 技术来修改竹节虫 Medauroidea extradentata 的基因组。作为概念验证，我们针对参与眼色素沉着的 ommochrome 途径的两个基因（朱砂和白色，分别为第二和第一外显子）以产生敲除 (KO) 突变体。产卵后 24 小时内进行微注射，重点关注单细胞（和单倍体）发育阶段。产生的 KO 导致朱砂和白色的眼睛和角质层颜色表型不同。纯合朱砂突变体的眼睛和表皮呈现淡色色素沉着，而纯合白色 KO 导致发育中的胚胎完全无色素表型。总之，我们表明 CRISPR/Cas9 可以成功应用于 M. extradentata 的基因组，从而产生表型不同且可存活的动物。现在可以使用这种遗传工具箱，利用孤雌生殖非模式生物创建稳定的转基因品系。
NEXMIF/KIDLIA 基因敲除小鼠展现出自闭症......
自闭症谱系障碍 (ASD) 是一种异质性神经发育障碍，表现为社交互动障碍、沟通障碍以及限制性和重复性行为。ASD 具有很强的遗传基础，迄今为止已发现了许多与 ASD 相关的基因。我们之前的研究表明，X 连锁基因 NEXMIF/KIDLIA 表达的缺失与具有自闭症特征和智力障碍 (ID) 的患者有关。为了进一步确定基因在疾病中的因果作用，并了解病理学背后的细胞和分子机制，我们生成了 NEXMIF 敲除 (KO) 小鼠。我们发现雄性 NEXMIF KO 小鼠表现出社交能力和沟通能力下降、重复梳理行为增多以及学习和记忆能力下降。NEXMIF/KIDLIA 表达的缺失导致突触密度和突触蛋白表达显著降低。通过测量海马中的兴奋性微征和突触后电流，雄性 KO 动物始终表现出异常的突触功能。这些发现表明，NEXMIFKO 小鼠重现了人类疾病的表型。NEXMIFKO 小鼠模型将成为研究 ASD 所涉及的复杂机制和开发这种疾病的新型疗法的宝贵工具。
利用专有脂质实现体内基因编辑...
• 小鼠品系：C57BL/6 和 ApoE KO • 剂量：1 mg/kg • Life Edit LNP • mRNA：fLuc + b-gal 组合 (1:1) • 时间点：静脉注射后 6 小时
2018 年 TUKE 活动报告
科希策技术大学 (TUKE) 为周边地区提供科技知识库、创新和劳动力，以塑造有益且可持续的未来和提高公民的生活质量。科希策科技大学通过大学各院系所有科学领域的创新研究和卓越教育实现了这一目标。