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Komagataella phaffii（毕赤酵母）作为一种强大的酵母...
Komagataella phaffii (K. phaffii) (Pichia pastoris)，也称为生物技术酵母，是一种在生物技术和制药行业中具有多种应用的酵母菌种。这种甲基营养酵母作为重组蛋白的生产平台引起了人们的极大兴趣。它具有许多优点，包括有效的分泌表达，便于纯化异源蛋白，细胞密度高，生长迅速，翻译后变化，以及整合到基因组中的稳定基因表达。在过去的三十年里，K. phaffii 还被精炼为一个适应性强的细胞工厂，可以在实验室环境和工业规模上生产数百种生物分子。事实上，迄今为止，使用 K. phaffii 表达方法已经生成了 5000 多种重组蛋白，占细胞总蛋白的 30% 或总释放蛋白的 80%。除了已获得许可的 300 多种工业工艺外，K. phaffii 还用于制造 70 多种商业产品。其中包括对工业生物技术有用的酶，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶和植酸酶。其他是生物制药，包括人血清白蛋白、胰岛素、乙肝表面抗原和表皮生长因子。与其他表达系统相比，这种酵母还被认为是合成亚单位疫苗的特殊宿主，而亚单位疫苗最近已被替代疫苗类型所取代，例如灭活/杀死和减毒活疫苗。此外，通过多层次优化方法，如密码子偏好、基因剂量、启动子、信号肽和环境因素，可以实现重组蛋白的高效生产。因此，尽管 K. phaffii 表达系统高效、简单且工艺流程明确，但仍需确定理想条件，因为这些条件会根据目标蛋白而变化，以确保最高的重组蛋白生成量。本综述介绍了 K. phaffii 表达系统、其在工业和生物制药蛋白质生产中的重要性，以及一些高效蛋白质生产的生物加工和遗传改造策略。K. phaffii 最终将继续作为一种强大的表达系统在研究领域和工业应用中做出贡献。
CRISPR-MAD7 和 CRISPR-Cas9 在 Komagataella phaffii 中基因破坏的比较
摘要：基于 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）的技术是用于定点基因组修饰的强大、可编程工具。在成功改造并有效使用 CRISPR-Cas9 进行甲基营养酵母 Komagataella phaffii 的基因组工程后，人们希望有更多可用的核酸内切酶来增加实验灵活性，并在由于第三方的知识产权 (IPR) 而对工业研究有特定法律限制的情况下提供替代方案。MAD7 是一种工程化的 2 类 V 型 Cas 核酸酶，被推广为学术和工业研究的免版税替代品，由 Inscripta（美国加利福尼亚州普莱森顿）开发。本研究首次将CRISPR-MAD7用于K. phaffii基因组编辑，对编码甘油激酶1（GUT1）、红色荧光蛋白（DsRed）和zeocin抗性基因（Sh ble）的三个靶基因均获得了较高的基因编辑率（高达90%）。此外，还通过靶向K. phaffii中的259个激酶基因，系统地比较了CRISPR-MAD7和CRISPR-Cas9系统的基因组编辑效率。在这次大范围的测试中，与应用的CRISPR-MAD7工具箱（约23%）相比，CRISPR-Cas9具有更高的基因组编辑率，约为65%。
评估在Komagataella phaffii中表达的重组人乳铁蛋白的潜在食物过敏风险
1 Helaina，Inc，345 Park Ave，South，South，New York，New York，10010 USA。 yanisa@myhelaina.com; raysa@myhelaina.com; shashwat@myhelaina.com; xiaoning@myhelaina.com; ross@myhelaina.com; isabella@myhelaina.com; kahler@myhelaina.com; anthony.clark@myhelaina.com; carrie@myhelaina.com 2 Re Goodman Consulting，8110 Dougan Circle，NE NE，NE，68516美国。 rgoodman2@unl.edu 3内布拉斯加州林肯大学的食物过敏研究与资源计划，1901年North 21 St Street Po Box 886207美国。 Philip.johnson@unl.edu 4独立学者，加利福尼亚州圣地亚哥，美国92108。 sarah.dimitratos@gmail.com 5俄勒冈健康与科学大学，3181 SW Sam Jackson Park Rd，波特兰，俄勒冈州，美国97212； scottoli@ohsu.edu *通讯作者信息：Carrie-Anne Malinczak； carrie@myhelaina.com; 734- 657-2414摘要：在将新型食品成分引入食品供应之前，安全风险评估为1 Helaina，Inc，345 Park Ave，South，South，New York，New York，10010 USA。yanisa@myhelaina.com; raysa@myhelaina.com; shashwat@myhelaina.com; xiaoning@myhelaina.com; ross@myhelaina.com; isabella@myhelaina.com; kahler@myhelaina.com; anthony.clark@myhelaina.com; carrie@myhelaina.com 2 Re Goodman Consulting，8110 Dougan Circle，NE NE，NE，68516美国。rgoodman2@unl.edu 3内布拉斯加州林肯大学的食物过敏研究与资源计划，1901年North 21 St Street Po Box 886207美国。Philip.johnson@unl.edu 4独立学者，加利福尼亚州圣地亚哥，美国92108。 sarah.dimitratos@gmail.com 5俄勒冈健康与科学大学，3181 SW Sam Jackson Park Rd，波特兰，俄勒冈州，美国97212； scottoli@ohsu.edu *通讯作者信息：Carrie-Anne Malinczak； carrie@myhelaina.com; 734- 657-2414摘要：在将新型食品成分引入食品供应之前，安全风险评估为Philip.johnson@unl.edu 4独立学者，加利福尼亚州圣地亚哥，美国92108。sarah.dimitratos@gmail.com 5俄勒冈健康与科学大学，3181 SW Sam Jackson Park Rd，波特兰，俄勒冈州，美国97212； scottoli@ohsu.edu *通讯作者信息：Carrie-Anne Malinczak； carrie@myhelaina.com; 734- 657-2414摘要：在将新型食品成分引入食品供应之前，安全风险评估为
在 Komagataella phaffii 中通过宿主知情表达 CRISPR 引导 RNA 进行基因组工程
人们对使用非模式微生物作为生物制药制造宿主的兴趣日益浓厚。这些宿主需要进行基因组工程以满足临床相关的产品质量和滴度，但对于特征不明显的宿主，CRISPR-Cas9 等基因组编辑工具的适应性发展一直很缓慢。具体而言，缺乏对 RNA 聚合酶 III 转录的生化表征阻碍了向导 RNA 在新宿主中的可靠表达。在这里，我们提出了一种基于测序的策略，用于设计宿主特异性盒式磁带，以实现向导 RNA 的模块化、可靠表达。使用这种策略，我们在甲基营养酵母 Komagataella phaffii 中实现了高达 95% 的基因编辑效率。我们将这种方法应用于复杂表型的快速、多重工程，通过两个连续的工程步骤实现人源化产品糖基化。将简单的基因编辑工具可靠地扩展到非模型制造宿主，将能够快速设计针对特定产品配置的制造菌株，并可能降低工艺开发的成本和时间。