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蛋白酶抑制剂是针对内脏利什曼病的潜在药物：激发未来研究的评论
更加危险。是由淋巴器官（主要是脾脏，骨髓和肝脏）感染的血细胞引起的，如果未治疗，通常是致命的。HEP-拟南芥，贫血，发烧，卡氏症和白细胞减少症都是VL的症状。 利什曼病的长期课程可能需要数月甚至数年的发展。 在亚洲，印度和中东国家中发现的主要是利什曼原虫物种会导致VL；位于南美洲和中美洲的利什曼原虫物种会引起皮肤，内脏和粘膜皮肤病。 在骨髓的血细胞，网状内皮结构和皮肤中，原生动物的尺寸非常小，使诊断有利什 - 素质症具有挑战性。 2在疾病的更严重类型中，疗法长期以来一直具有挑战性，耐药性的出现使其更具挑战性。 没有有效的利什曼病疫苗接种。 因此，本文审查了利什曼病的背景，当前情况和治疗以及药物靶位部位GP63以及来自海洋放线杆菌的蛋白酶抑制剂，用于针对这些GP63分子的药物开发。HEP-拟南芥，贫血，发烧，卡氏症和白细胞减少症都是VL的症状。利什曼病的长期课程可能需要数月甚至数年的发展。在亚洲，印度和中东国家中发现的主要是利什曼原虫物种会导致VL；位于南美洲和中美洲的利什曼原虫物种会引起皮肤，内脏和粘膜皮肤病。在骨髓的血细胞，网状内皮结构和皮肤中，原生动物的尺寸非常小，使诊断有利什 - 素质症具有挑战性。2在疾病的更严重类型中，疗法长期以来一直具有挑战性，耐药性的出现使其更具挑战性。没有有效的利什曼病疫苗接种。因此，本文审查了利什曼病的背景，当前情况和治疗以及药物靶位部位GP63以及来自海洋放线杆菌的蛋白酶抑制剂，用于针对这些GP63分子的药物开发。
在地中海盆地（巴利阿里群岛）的一个地方性地区，由利什曼原虫造成的人皮肤利什曼病低估了人皮肤利什曼病
摘要：利什曼病是一种由利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起的传染性人畜共患病。在地中海盆地中，利什曼病是由leishmania Invantum引起的，并由phlebotomus属的沙片叮咬传播，狗是主要的储层宿主。最常见的形式是皮肤利什曼病（CL），尽管也发生了内脏病例。这项研究的目的是评估中等地中海地区CL的低估。因此，对在Manacor医院（马略卡岛，巴利阿里群岛）的皮肤病学服务中诊断和治疗的所有CL病例进行了回顾性研究，并将获得的数据与同一时期的地方政府流行病学公告的数据进行了比较。编制了不同的临床表现，并分析了与性别，年龄和病变类型和数量有关的数据。结果显示出明确的亚通知，这表明该地区人类CL的实际发生率尚不清楚。
利什曼原虫的遗传多样性和基因组可塑性对治疗和寻找新型化疗靶点的影响
利什曼病是拉丁美洲、非洲、亚洲和欧洲的主要公共卫生问题之一。由于缺乏人用疫苗和有效的媒介控制计划，化疗成为控制所有形式该疾病的主要策略。然而，现有药物的高毒性、治疗药物的选择有限以及耐药性寄生虫菌株的出现是与化疗相关的主要挑战。目前，只有少数药物可用于利什曼病治疗，包括五价锑化合物 (SbV)、两性霉素B及其制剂、米替福新、硫酸巴龙霉素和羟乙基磺酸喷他脒。除了药物毒性之外，利什曼病的治疗失败也是一个严重的问题。耐药性寄生虫的出现是治疗失败的原因之一，并且与该属寄生虫的多样性密切相关。由于基因组具有巨大的可塑性，抗药性可以通过改变不同的代谢途径产生，这表明抗药性机制是多因素的，极其复杂。遗传变异和基因组可塑性不仅导致现有药物存在局限性，而且使寻找新药变得具有挑战性。在这里，我们研究了阻碍药物发现的寄生虫的生物学特性。
推出 CRISPR/Cas9 胞嘧啶碱基编辑器工具箱“LeishBASEedit”——无需 DNA 双链断裂、同源重组或供体 DNA 即可对利什曼原虫进行基因编辑和高通量筛选
。CC-BY-NC 4.0 国际许可证永久有效。它是在预印本（未经同行评审认证）下提供的，作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。此版本的版权持有者于 2022 年 12 月 8 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.12.08.519658 doi：bioRxiv 预印本
基因组缺失可克服利什曼原虫基因功能的定向丧失
随着被忽视的热带疾病利什曼病在全球范围的蔓延，再加上治疗方法有限，且这些治疗方法都存在耐药性、成本、毒性和/或给药问题，在病原昆虫媒介原生动物利什曼原虫中验证新药物靶点比以往任何时候都更加重要。在 2015 年引入 CRISPR Cas9 技术之前，新靶点的基因验证主要通过同源重组进行靶向基因敲除，其中大多数靶向基因（约 70%）被视为非必需基因。在本研究中，我们利用现成的全基因组测序技术重新分析了这些历史细胞系之一，即 L. major 敲除丝氨酸棕榈酰转移酶 (LCB2) 催化亚基，这会导致鞘脂生物合成完全丧失，但仍具有活力和感染性。结果发现了许多单核苷酸多态性，但也揭示了几个编码区的完全丢失，包括一个编码假定的 ABC3A 直系同源物（假定的固醇转运蛋白）的基因。假设这种转运蛋白的缺失可能促进了 LCB2 催化亚基的定向敲除和从头鞘脂生物合成的完全丧失，我们重新检查了 L. mexicana 品系中的 LCB2，该品系经过工程改造，可直接通过 CRISPR Cas9 定向操作。令人惊讶的是，LCB2 无法被敲除，表明其是必需的。然而，同时删除 LCB2 和假定的 ABC3A 是可能的。这表明假定的 ABC3A 的缺失促进了利什曼原虫中鞘脂生物合成的丧失，并表明我们应该重新检查许多其他基因被视为非必需的利什曼原虫敲除品系。
关于针对槲皮素的新利什人类药物靶标的计算研究
利什曼病，是一种由利什曼原虫寄生虫引起的寄生疾病，位于感染的沙蝇中。控制利什曼病仍然是全世界引起严重关注的根源。关于利什曼病的研究引发了研究，因为它在亚洲，东非和南美的热带和亚热带地区爆发。迫切需要新的治疗性干预措施，例如疫苗和新药物靶标，因为它具有对可用药物的抗性。槲皮素，多酚类黄酮的衍生物通过与蛋白质和核酸相互作用表现出各种生物学活性。在这项研究中，进行了计算分析，以通过分子对接在利什曼原虫物种中识别槲皮素的潜在药物靶标。新预测的靶标受到亚细胞定位预测，并确定蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，该网络将有助于开发抗脊髓药。这项研究有助于鉴定靶标和抗脊髓药物的发展。
系统鉴定编码细胞表面和分泌蛋白的基因，这些基因对于杜氏利什曼原虫体外生长和感染至关重要
利什曼病是一种由利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起的传染病，目前尚无获批的人类疫苗。感染以物种特异性的方式定位到不同的组织，由杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫引起的内脏疾病对人类最为致命。尽管利什曼原虫属寄生虫主要在细胞内，但可以通过给狗接种婴儿利什曼原虫前鞭毛体培养物分泌产物的复杂混合物来预防内脏疾病。由于细胞外寄生虫蛋白可直接与疫苗诱导的宿主抗体接触，因此它们是良好的亚单位疫苗候选物，因此我们在此尝试发现对体外生长和宿主感染至关重要的蛋白质，目的是确定亚单位疫苗候选物。通过对杜氏利什曼原虫基因组进行计算机分析，我们确定了 92 个编码蛋白质的基因，这些蛋白质预测会通过单个跨膜区或 GPI 锚点分泌或外部锚定在寄生虫膜上。通过选择一种同时表达荧光素酶和 Cas9 核酸酶的转基因杜氏利什曼原虫，我们系统地尝试通过 CRISPR 基因组编辑靶向所有 92 个基因，并确定了体外生长所需的四个基因。对于 55 个基因，我们用每种突变寄生虫感染了小鼠群，并通过使用生物发光成像纵向量化寄生虫血症，结果显示 9 个基因有减毒感染的证据，尽管所有基因最终都建立了感染。最后，我们将两个基因表达为全长可溶性重组蛋白，并在小鼠临床前感染模型中将它们作为亚单位疫苗候选物进行测试。这两种蛋白质都对脾脏感染的不受控制的发展产生了显著的保护作用，值得进一步研究作为针对这种致命的热带传染病的亚单位疫苗候选物。
利什曼原虫的遗传多样性和基因组可塑性对治疗和寻找新型化疗靶点的影响
利什曼病是拉丁美洲、非洲、亚洲和欧洲的主要公共卫生问题之一。由于缺乏人用疫苗和有效的媒介控制计划，化疗成为控制所有形式该疾病的主要策略。然而，现有药物的高毒性、治疗药物的选择有限以及耐药性寄生虫菌株的出现是与化疗相关的主要挑战。目前，只有少数药物可用于利什曼病治疗，包括五价锑化合物 (SbV)、两性霉素B及其制剂、米替福新、硫酸巴龙霉素和羟乙基磺酸喷他脒。除了药物毒性之外，利什曼病的治疗失败也是一个严重的问题。耐药性寄生虫的出现是治疗失败的原因之一，并且与该属寄生虫的多样性密切相关。由于基因组具有巨大的可塑性，抗药性可以通过改变不同的代谢途径产生，这表明抗药性机制是多因素的，极其复杂。遗传变异和基因组可塑性不仅导致现有药物存在局限性，而且使寻找新药变得具有挑战性。在这里，我们研究了阻碍药物发现的寄生虫的生物学特性。
稳定表达 Cas9 和 T7 RNA 聚合酶的利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 的有效基因组编辑
直到 2015 年，阐明利什曼原虫蛋白质功能的功能丧失研究都依赖于通过同源重组进行基因破坏。随后，CRISPR/Cas9 革命影响到了这些原生动物寄生虫，只需一轮转染即可实现有效的基因组编辑。此外，LeishGEdit 的开发（一种基于 PCR 的工具包，用于使用 CRISPR/Cas9 生成敲除和标记系）使基因组编辑更加直接有效。在此系统中，质粒 pTB007 被递送至利什曼原虫，在 b-微管蛋白基因座中进行游离表达或整合，并稳定表达 T7 RNA 聚合酶和 Cas9。在南美洲，尤其是在巴西，利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 是皮肤利什曼病最常见的病原体。与利什曼原虫相比，L. braziliensis b-微管蛋白基因座表现出显著的序列差异，这阻碍了 pTB007 的有效整合和 Cas9 的稳定表达。为了克服这一限制，pTB007 中存在的 L. major b-微管蛋白序列被利什曼原虫 (Viannia) b-微管蛋白保守序列取代，从而产生了 pTB007_Viannia 质粒。这一修改使 pTB007_Viannia 盒式磁带成功整合到 L. braziliensis M2903 基因组中，并且计算机预测表明这也可以在其他 Viannia 物种中实现。通过敲除鞭毛蛋白 PF16 来评估 Cas9 的活性，这导致这些转染子中出现不动表型。内源性PF16也成功被mNeonGreen标记，并采用基因座互补策略将PF16基因的C端标记拷贝返回到原始基因座，从而恢复游泳能力。
以 CRISPR-Cas9 为主要靶点构建 PX-LmGP63，用于利什曼原虫 GP63 基因敲除及利什曼化
背景：利什曼原虫是一种细胞内原生动物寄生虫，它使用复杂的方法破坏哺乳动物宿主巨噬细胞的先天免疫反应。已发现许多因素会影响寄生虫致病性的严重程度。其中一个因素是 GP63，它是一组破坏宿主细胞信号传导机制的金属蛋白酶。目的：本研究旨在通过 CRISPR-Cas9 构建 PX-LMGP63 载体，用于利什曼原虫中的 GP63 基因敲除，作为一种潜在的利什曼化方法。方法：根据 GP63 的 mRNA 序列设计一对 gRNA。然后将退火引物克隆到线性化载体 PX-459 中并转化到 DH5 A 感受态细胞中。然后，使用基因特异性和载体引物进行 PCR 检测以确认菌落。此外，对构建的质粒进行测序以进行最终确认。结果：PCR证实了预期大小为270的条带。质粒测序显示gRNA789已连接到载体上。构建的结构被命名为PX-LMGP63，下一步将转染到前鞭毛体细胞中。结论：由于皮肤利什曼病在大多数国家流行并成为公共卫生问题，并且缺乏有效的利什曼病疫苗，使用CRISPR方法可能使未来获得有效的疫苗成为可能。