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研究论文基于基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除筛选促进退出幼稚多能性的基因
干细胞和再生医学面临的两个主要问题是多能性的退出和向功能性细胞或组织的分化。这两个问题的答案对于干细胞和再生医学研究的临床转化具有重要意义。尽管越来越多的研究揭示了多能性维持的真相，但多能细胞自我更新、增殖和向特定细胞谱系或组织分化的机制尚不清楚。为此，我们充分利用了一项新技术，即基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除 (GeCKO)。作为一种在基因组特定位点引入靶向功能丧失突变的有效方法，GeCKO 能够首次以无偏向的方式筛选促进小鼠胚胎干细胞 (mESC) 退出多能性的关键基因。本研究成功建立了基于GeCKO的模型，用于筛选多能性退出的关键基因。我们的策略包括慢病毒包装感染技术、lenti-Cas9基因敲除技术、shRNA基因敲除技术、二代测序、基于模型的基因组规模CRISPR-Cas9敲除分析（MAGeCK分析）、GO分析等方法。我们的研究结果为大规模筛选多能性退出基因提供了一种新方法，为细胞命运调控研究提供了一个切入点。
正常细胞和恶性细胞在染色体脆性和神经节苷脂表达方面的表型差异
通过光学显微镜观察 8 名恶性肿瘤患者和 8 名健康对照者的外周血淋巴细胞的中期，检测了自发性染色体脆性。在受试患者中，与对照组相比，自发性染色体脆性的频率明显更高，尤其是在着丝粒染色体区域。特别令人感兴趣的是涉及神经节苷脂、三肽谷胱甘肽 (GSH) 的还原形式和/或肿瘤抑制蛋白 HACE1 的相互作用。在实验室培养的小鼠胚胎 3T3 成纤维细胞、小鼠恶性骨髓瘤细胞以及两种细胞类型的混合培养物的实验体外模型提取物中神经节苷脂和抗神经节苷脂抗体的平均滴度之前，先将每个提取物通过 GSH-琼脂糖柱，以“选择”所述样本中对 GSH 具有亲和力的分子。此外，还测试了肿瘤抑制基因 HACE-1 在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 和恶性人类宫颈癌 HeLa 细胞基因组中的存在和表达，这两种细胞都含有该基因的额外拷贝，通过用含有肿瘤抑制基因拷贝的适当重组 DNA 载体转染插入。开发的实验体外模型显示了特定的分子间相互作用，可以阻止疾病的发展。此外，还展示了非淋巴细胞类型产生抗体/免疫球蛋白的可能性。因为以这种方式产生的抗体位于专门的淋巴组织和器官中的生发中心之外，所以通过小离子和分子（如神经节苷脂）控制它们的功能非常重要。
能源部 - DOE 科学办公室
能源部 能源效率和可再生能源 2,861,760 2,861,760 4,018,885 1,157,125 40.4% 电力 211,720 211,720 297,386 85,666 40.5% 网络安全、能源安全和应急响应 156,000 156,000 202,143 46,143 29.6% 石油储备 战略石油储备 188,000 188,000 214,175 26,175 13.9% 海军石油和油页岩储备 13,006 13,006 13,004 -2 0.0% SPR - 石油账户1,000 1,000 8,000 7,000 700.0% 东北家庭取暖用油储量 6,500 6,500 7,000 500 7.7% 石油储量小计 208,506 208,506 242,179 33,673 16.1% 电网部署办公室 - - 90,221 90,221 N/A 联邦能源管理计划 (FEMP) - - 169,661 169,661 N/A 制造与能源供应链办公室 (MESC) - - 27,424 27,424 N/A 州和社区能源计划办公室 (SCEP) - - 726,897 726,897 N/A 核能 1,357,800 1,357,800 1,518,460 160,660 11.8% 核废料处理 27,500 27,500 10,205 -17,295 -62.9% 化石能源和碳管理 750,000 750,000 893,160 143,160 19.1% 铀浓缩净化和退役基金（UED&D） 841,000 841,000 822,421 -18,579 -2.2% 能源信息署 126,800 126,800 144,480 17,680 13.9% 非国防环境清理 319,200 319,200 323,249 4,049 1.3% 科学 7,026,000 7,026,000 7,799,211 773,211 11.0% 技术转型办公室 - - 21,558 21,558 N/A 清洁能源示范办公室 - - 214,052 214,052 N/A 高级研究计划局-能源 427,000
人类月经衍生的子宫内膜干细胞通过改善小鼠脊髓中的炎症微环境
抽象的脊髓损伤（SCI）是中枢神经系统的创伤性损伤。由于神经元在SCI后受损且难以再生，因此其修复仍然具有挑战性。然而，关于干细胞疗法的最新研究有利于SCI之后的使用。在这项研究中，基于建立小鼠SCI模型，人性衍生的子宫内膜干细胞（MENSC）被固定地注入，以探索MENSC在SCI中的作用和分子机制。MENSC，行为评估表明MENSC移植改善了功能恢复。因此，在7天后收集样品，并进行转录组测序。基因本体论（GO）富集分析表明，SCI与免疫系统过程密切相关。MENSC移植后，免疫反应显着激活。在基因和基因组分析的京都百科全书中，发现MENSC移植与TH1，TH2和TH17细胞分化途径密切相关。通过荧光免疫组织化学检测到不同组的神经元损伤和神经胶质细胞的增殖和激活，SCI后7天进行了蛋白质印迹。同时检测到不同类型的小胶质细胞的激活，并定量分析了促炎和抗炎因子的表达。本研究为研究MESC在SCI修复中的作用和分子机制提供了实验基础，并参考了SHH诱导的MENSC在SCI修复中的作用。结果表明，MENSC移植和声音刺猬（SHH）诱导的MESCS在受伤部位加速了神经元的恢复，抑制了神经胶质细胞的形成和受伤部位的小胶质细胞激活，抑制了炎症因子的表达，并改善了炎症性微观的条件，以提高功能性回收。
四邻苯酚对分化小鼠胚胎干细胞的影响揭示了对免疫系统的意外影响
四抗苯酚A（TBBPA）是用于多种设备中使用的有效的木质阻滞剂，是家庭和生态系统中的主要污染物。在脊椎动物中，它被证明会影响神经发育，下丘脑 - 垂体 - 基达轴和甲状腺信号传导，但其毒性和作用方式仍然是争论的问题。暴露于TBBPA引起的分子表型仅描述了很差，尤其是在转录组重编程水平上，这进一步限制了我们对其分子毒性的理解。在这项工作中，我们将功能基因组学和系统生物学结合在一起，提供了对作用于MESC的TBBPA引起的转录组改变的系统描述，并提供了潜在的新毒性标记。我们发现TBBPA诱导的转录组重编程会影响生物途径网络中的大量基因集合，表明对生物过程的广泛干扰。我们还发现了两个作用热点：在神经元分化标记的水平上，令人惊讶的是，在免疫系统功能的水平上，到目前为止，它们在很大程度上被忽略了。这种效果特别强，因为髓样和淋巴样谱系的末端分化标记均大大降低：膜T细胞受体（CD79A，CD79B），白介素七受体（IL7R），巨噬细胞粒细胞因子受体（CSF1R），单细胞激素受体（CCR2）。此外，强烈诱导了高属性IgE受体（FCER1G），是过敏反应的关键介体。因此，TBBPA诱导的分子不平衡可能比最初实现的强。
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
一项针对英联邦太平洋岛上支持技术学习的基线研究
学习英联邦，2015©2015，由英联邦学习。此报告可在创意共享归因4.0许可（国际）下提供：http：//creativecommons.org/licences/by-sa/4.0。为了避免疑问，通过申请本许可，学习英联邦的学习并不能免除任何特权或免疫力，从而声称其可能有权主张，而学习的英联邦学习也不会提交给任何管辖权的管辖权，法院，法院，法律程序或法律。Report Prepared by: Leatuaolevao Ruby Vaa Campus Director Alafua Campus The University of the South Pacific Samoa Email: vaa_r@samoa.usp.ac.fj Acknowledgements The author gratefully acknowledges the support received from the following whilst preparing this report: Fiji : Mr. Ian Thomson, Manager, Teachers Education Resources and e-Learning Centre (TEREC), USP劳卡拉校园；斐济高等教育委员会主任Salote Rabuka女士；斐济高等教育委员会OER专家Matai Tagicaki先生。基里巴蒂：USP Kiribati校园主任Uentabo Mackenzie博士。萨摩亚：通信和信息技术部长Tuisugaletaua Sofara Aveau荣誉；通信和信息技术部，教育，体育和文化部以及MESC Schoolnet项目团队的人员；首席执行官Laeimau Oketevi Tanuvasa-Savea女士和Suemalo Vesi Tusani女士；计算机服务有限公司； USP Samoa IT服务经理Sia Matalavea先生。所罗门群岛：USP所罗门群岛校园主任John Usuramo先生；所罗门群岛的罗斯·库迪女士和查尔斯·鲁伊克拉先生，教育和人力资源发展部。汤加：USP Tonga校园主任Ana Koloto博士。图瓦卢：USP Tuvalu校园主任David Manuella先生；教育；图瓦卢电信公司首席执行官Simeti Lopati先生。vanuatu：USP Vanuatu集团经理Reuben Markward先生和教育部John Niroa先生。USP IT服务：劳卡拉校园的USP主任Kisione Finau先生。在出版物中表达的观点是作者的观点，不一定反映了上校的观点。已尽一切努力承认并归因于本报告准备中使用的所有信息来源。编写报告时，文档中的所有链接都处于活动状态。发表者：学习联邦4710 Kingsway，Suite 2500 Burnaby，不列颠哥伦比亚省加拿大V5H 4M2电话：+1 604 775 8200传真：+1 604 775 8210 WEB：www.col.col.col.org e-mail e-mail：info@col.org.org
2023 财年国会预算申请 - 能源部
Prog 第 1703 条 负信用补贴收入 - - -7,000 -7,000 N/A UED&D 基金自由支配支出 - -417,000 -417,000 N/A 收入和抵消额 -9,000 -9,000 -433,000 -424,000 4711.1% 能源部 41,892,625 41,892,625 48,183,541 6,290,916 15.0%
2023 财年国会预算请求
$ % 能源部 能源效率和可再生能源 2,861,760 2,861,760 4,018,885 1,157,125 40.4% 电力 211,720 211,720 297,386 85,666 40.5% 网络安全、能源安全和应急响应 156,000 156,000 202,143 46,143 29.6% 石油储备 战略石油储备 188,000 188,000 214,175 26,175 13.9% 海军石油和油页岩储备 13,006 13,006 13,004 -2 0.0% SPR - 石油账户1,000 1,000 8,000 7,000 700.0% 东北家庭取暖用油储量 6,500 6,500 7,000 500 7.7% 石油储量小计 208,506 208,506 242,179 33,673 16.1% 电网部署办公室 - - 90,221 90,221 N/A 联邦能源管理计划 (FEMP) - - 169,661 169,661 N/A 制造与能源供应链办公室 (MESC) - - 27,424 27,424 N/A 州和社区能源计划办公室 (SCEP) - - 726,897 726,897 N/A 核能 1,357,800 1,357,800 1,518,460 160,660 11.8% 核废料处理 27,500 27,500 10,205 -17,295 -62.9% 化石能源和碳管理 750,000 750,000 893,160 143,160 19.1% 铀浓缩净化和退役基金（UED&D） 841,000 841,000 822,421 -18,579 -2.2% 能源信息署 126,800 126,800 144,480 17,680 13.9% 非国防环境清理 319,200 319,200 323,249 4,049 1.3% 科学 7,026,000 7,026,000 7,799,211 773,211 11.0% 技术转型办公室 - - 21,558 21,558 N/A 清洁能源示范办公室 - - 214,052 214,052 N/A 高级研究计划署-能源 427,000 427,000 700,150 273,150 64.0% 部门管理 166,000 166,000 397,203 231,203 139.3% 印度能源政策和计划 22,000 22,000 150,039 128,039 582.0% 监察长办公室57,739 57,739 106,808 49,069 85.0% 贷款计划标题 17 - 创新技术贷款担保计划 (1) 29,000 29,000 168,206 139,206 480.0% 先进技术汽车制造贷款计划 5,000 5,000 9,800 4,800 96.0% 部落能源贷款担保计划 2,000 2,000 1,860 -140 -7.0% 贷款计划小计 36,000 36,000 179,866 143,866 399.6% 能源计划小计 14,595,025 14,595,025 19,055,658 4,460,633 30.6% 国家核安全局联邦工资和费用 443,200 443,200 496,400 53,200 12.0% 武器活动 15,345,000 15,345,000 16,486,298 1,141,298 7.4% 国防核不扩散 2,260,000 2,260,000 2,346,257 86,257 3.8% 海军反应堆 1,684,000 1,684,000 2,081,445 397,445 23.6% 国家核安全局 19,732,200 19,732,200 21,410,400 1,678,200 8.5% 环境和其他国防活动 国防环境清理 6,426,000 6,426,000 6,914,532 488,532 7.6% 国防 UED&D 基金 (2) - - - - N/A 其他国防活动 920,000 920,000 978,351 58,351 6.3% 环境和其他国防活动小计 7,346,000 7,346,000 7,892,883 546,883 7.4% 核能 (050) 149,800 149,800 156,600 6,800 4.5% 原子能国防活动小计27,228,000 27,228,000 29,459,883 2,231,883 8.2% 电力营销管理局 东南电力管理局 (SEPA) - - - - N/A 西南电力管理局 (SWPA) 10,400 10,400 10,608 208 2.0% 西部地区电力管理局 89,372 89,372 98,732 9,360 10.5% Falcon 和 Amistad 运营和维护基金 228 228 228 0 0.0% 科罗拉多河流域营销基金 -21,400 -21,400 -8,568 12,832 -60.0% 电力营销管理局小计 78,600 78,600 101,000 22,400 28.5% 能源部小计 41,901,625 48,616,541 6,714,916 16.0% 联邦能源管理委员会 - - - - N/A 收据和抵消超额费用和回收，FERC -9,000 -9,000 -9,000 - 0.0% 第十七章贷款担保。计划第 1703 节 负信用补贴收入 - - -7,000 -7,000 N/A UED&D 基金自由支配支出 - -417,000 -417,000 N/A 收入和抵消额 -9,000 -9,000 -433,000 -424,000 4711.1% 能源部 41,892,625 41,892,625 48,183,541 6,290,916 15.0%
2023 财年国会预算申请 - 能源部
Prog 第 1703 条 负信用补贴收入 - - -7,000 -7,000 N/A UED&D 基金自由支配支出 - -417,000 -417,000 N/A 收入和抵消额 -9,000 -9,000 -433,000 -424,000 4711.1% 能源部 41,892,625 41,892,625 48,183,541 6,290,916 15.0%