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MMEJ 介导的 CRISPR 基因组编辑的长读序列分析揭示了复杂的
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2023 年 3 月 4 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.03.03.531065 doi：bioRxiv 预印本
连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。
基于 MMEJ 的精准基因编辑在基因治疗和功能基因组学中的应用
基因编辑实验通常会引发容易出错的非同源末端连接，以修复 DNA 双链断裂 (DSB)。微同源介导的末端连接 (MMEJ) 可以为功能基因组和躯体治疗应用产生更可预测的结果。MENTHU 是一种计算工具，可预测可能导致斑马鱼中 MMEJ 修复的同质基因型 (PreMA) 的核酸酶靶向位点。我们在小鼠胚胎干细胞中 5,885 个不同的 Cas9 介导的 DSB 上部署了 MENTHU，并将预测与另一种 DSB 修复预测算法 inDelphi 的预测进行了比较。MENTHU 正确识别了所有可用 PreMA 中的 46%，灵敏度是 inDelphi 的两倍。我们还引入了 MENTHU@4，这是在这个大型数据集上训练的 MENTHU 更新。我们在这个更大的数据集上训练了两种基于 MENTHU 的算法，并相互验证了它们，MENTHU 和 inDelphi。最后，我们估计了脊椎动物编码区中 SpCas9 可靶向 PreMA 的频率和分布，以评估基于 MMEJ 的基因发现靶向性。54 个基因中有 44 个（81%）至少包含一个早期的框架外 PreMA，而当同时考虑 Cas12a 时，54 个基因中有 48 个（89%）也包含至少一个早期的框架外 PreMA。我们认为 MMEJ 可以大规模部署用于反向遗传学筛选，并且具有足够的基因内密度率，几乎可以用于所有基于功能丧失的基因编辑治疗应用。