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连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。
基于 MMEJ 的精准基因编辑在基因治疗和功能基因组学中的应用
基因编辑实验通常会引发容易出错的非同源末端连接，以修复 DNA 双链断裂 (DSB)。微同源介导的末端连接 (MMEJ) 可以为功能基因组和躯体治疗应用产生更可预测的结果。MENTHU 是一种计算工具，可预测可能导致斑马鱼中 MMEJ 修复的同质基因型 (PreMA) 的核酸酶靶向位点。我们在小鼠胚胎干细胞中 5,885 个不同的 Cas9 介导的 DSB 上部署了 MENTHU，并将预测与另一种 DSB 修复预测算法 inDelphi 的预测进行了比较。MENTHU 正确识别了所有可用 PreMA 中的 46%，灵敏度是 inDelphi 的两倍。我们还引入了 MENTHU@4，这是在这个大型数据集上训练的 MENTHU 更新。我们在这个更大的数据集上训练了两种基于 MENTHU 的算法，并相互验证了它们，MENTHU 和 inDelphi。最后，我们估计了脊椎动物编码区中 SpCas9 可靶向 PreMA 的频率和分布，以评估基于 MMEJ 的基因发现靶向性。54 个基因中有 44 个（81%）至少包含一个早期的框架外 PreMA，而当同时考虑 Cas12a 时，54 个基因中有 48 个（89%）也包含至少一个早期的框架外 PreMA。我们认为 MMEJ 可以大规模部署用于反向遗传学筛选，并且具有足够的基因内密度率，几乎可以用于所有基于功能丧失的基因编辑治疗应用。
微同源性介导的末端连接记事
遗传信息的保真度对于细胞功能和生存力至关重要。DNA 双链断裂 (DSB) 对基因组完整性构成重大威胁，需要有效的修复机制。虽然主要的修复策略通常是准确的，但矛盾的是，也存在容易出错的途径。本综述探讨了微同源介导的末端连接 (MMEJ) 的最新进展和我们对它的理解，MMEJ 是一种在生物体中保守的内在致突变 DSB 修复途径。MMEJ 的核心是 DNA 聚合酶 theta (Pol θ ) 的活性，它是一种促进 MMEJ 致突变性的专门聚合酶。我们研究了 MMEJ 活性背后的分子复杂性，并讨论了其在有丝分裂过程中的功能，其中 Pol θ 的活性作为解决持久性 DSB 的最后一搏而出现，尤其是当同源重组受到损害时。我们探索了针对 Pol θ 在癌症治疗和基因组编辑中的有希望的治疗应用。最后，我们讨论了 MMEJ 的进化后果，强调了它在保护基因组完整性和驱动基因组多样性之间的微妙平衡。
MMEJ 介导的 CRISPR 基因组编辑的长读序列分析揭示了复杂的
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2023 年 3 月 4 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.03.03.531065 doi：bioRxiv 预印本
DNA双链破裂修复蛋白的依赖性
DNA双链断裂通过多种途径修复，包括非同源最终连接（NHEJ）和微学介导的端连接（MMEJ）。这些途径的平衡取决于局部染色质的环境，但是对基本机制的理解很少。通过将敲除筛选与双重MMEJ：NHEJ报告基因插入在19种不同的染色质环境中，我们识别了数十种DNA修复蛋白，这些DNA修复蛋白调节途径取决于局部染色质状态。偏爱NHEJ的蛋白质主要与斑塑素协同作用，而有利于MMEJ的蛋白通常与不同类型的异染色质协同作用。前者的例子是BRCA2和民意调查，后者是幻想综合体和ATM。此外，在各种人类癌症类型中，其中几种蛋白质的丧失改变了杂染色质和全染色质之间途径特异性突变的分布。一起，这些结果发现了一个复杂的蛋白质网络，该蛋白质以染色质上下文与依赖性方式调节MMEJ：NHEJ平衡。
鉴定大脑中新的睫状信号通路和对神经系统疾病的见解
两种DNA修复途径，非同源末端连接（NHEJ）和替代末端连接（A-EJ），参与V（d）J重组和染色体易位。先前的研究报告了染色体易位的不同修复机制，NHEJ主要参与小鼠的人类和A-EJ。nhej取决于DNA-PKC，这是突触形成和下游成分激活的关键伴侣。虽然DNA-PKC抑制作用促进了具有小鼠微论的染色体易位，但其在人类中的同义效应尚不清楚。我们发现人类细胞中的部分DNA-PKC抑制会导致易位增加，并持续参与抑制的NHEJ。相比之下，完全增加了微学介导的末端连接（MMEJ），因此完全增加了DNA-PKC，从而弥合了人与小鼠之间的两种不同的易位机制。与先前关于KU70缺失的研究类似，G1/G0相小鼠祖细胞B细胞系中的DNA-PKCS缺失显着损害V（d）J重组，并由于编码失调和信号终端连接而产生了更高的易位速率。遗传DNA-PKC抑制完全抑制了NHEJ的参与，其表型上的修复类似于KU70缺乏的A-EJ。相比之下，我们发现在产生与Lig4缺乏相关的近乎异常的MMEJ时，DNA-PKCS所需的DNA-PKC。我们的研究强调了DNA-PKC抑制非法染色体重排，同时也有助于这两种物种的MMEJ。
科学期刊
泛素化是通过电离辐射（IR）诱导的DNA双链断裂（DSB）的正确修复所需的至关重要的翻译后修饰。dsbs主要通过同源重组（HR）修复，并且在不存在的情况下非同源末端连接（NHEJ）。此外，微型学介导的终端连接（MMEJ）和单链退火（SSA）提供了备份DSBS修复途径。然而，控制其使用的机制仍然知之甚少。通过在IR之后使用泛素系统的高分辨率CRISPR筛选，我们会系统地揭示细胞存活所需的基因，并阐明E3泛素连接酶SCF Cyclin F在依赖细胞周期依赖性DSB修复中的关键作用。我们表明，SCF细胞周期蛋白介导的EXO1降解可防止有丝分裂中的DNA末端切除，从而允许MMEJ发生。此外，我们确定了一个保守的细胞周期蛋白识别基序，与其他细胞周期蛋白所使用的基序不同，对细胞周期蛋白的特异性具有广泛的影响。
小分子polu抑制剂可提供安全有效...
摘要◥目的：DNA聚合酶theta（POL Q，由POLQ基因编码）是一种DNA修复酶，对微学末端结合（MMEJ）至关重要。pol q在正常组织中的表达有限，但在癌细胞中经常过表达，因此代表了肿瘤特异性放射性化的理想靶标。在这项研究中，我们评估用新型的小分子抑制剂靶向POL Q是提高放射疗法效率的可行策略。实验设计：我们表征了在体外和体内不同癌细胞模型中对POL Q抑制的反应。结果：在这里，我们表明ART558和ART899是POL Q DNA聚合酶域的两个新颖和特定的变构抑制剂，可有效地放射敏感性肿瘤细胞，尤其是当组合
整体和局部操纵 DNA 修复机制以改变造血干细胞中位点特异性基因编辑结果
血液系统的单基因疾病有可能通过体外自体干细胞移植来治疗，移植的是经过基因改造的造血干细胞和祖细胞 (HSPC)。sgRNA/Cas9 系统允许以单核苷酸分辨率精确修改基因组。然而，该系统依赖于内源性细胞 DNA 修复机制来修复 Cas9 诱导的双链断裂 (DSB)，无论是通过非同源末端连接 (NHEJ) 途径还是通过细胞周期调节的同源定向修复 (HDR) 途径。在这里，我们描述了一组异位表达的 DNA 修复因子和 Cas9 变体，评估它们在 HBB 基因座上通过 HDR 促进基因校正或通过 NHEJ 抑制基因破坏的能力。尽管 DNA 修复因子的短暂整体过度表达不会提高原代 HSPC 中基因校正的频率，但通过与 Cas9 蛋白融合将因子定位到 DSB 确实改变了修复结果，朝着微同源介导的末端连接 (MMEJ) 修复（HDR 事件）的方向发展。当可预测的基因编辑结果对于治疗成功至关重要时，这种策略可能很有用。
基因组编辑
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