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体外 CRISPR/CasRx 介导的 RNA 编辑方法
与使用 CRISPR/Cas 系统进行 DNA 操作不同，关于基于 CRISPR/Cas 的 RNA 修饰的文献严重缺乏。最近，科学家对 Cas13 酶进行了表征，并证明可编程 RNA 编辑在效率和特异性方面优于现有的 RNA 靶向方法（Abudayyeh 等人，2017 年；Cox 等人，2017 年；Liu 等人，2017 年；Konermann 等人，2018 年）。据报道，由于缺乏基因组改变，CRISPR/Cas13 也比现有的 CRISPR/Cas 系统更安全。2018 年，最小的 RNA 靶向 Cas 核酸酶 Cas13d 被描述。在 Cas13d 家族中，来自 Ruminococcus flavifaciens 的 CasRx（也称为 RfxCas13d）具有最高的 RNA 裂解活性和在人类细胞中的特异性。CasRx 的 RNA 靶向也比短发夹 RNA (shRNA) 干扰效果更好。重要的是，Cas13d 核酸酶可以处理 CRISPR 阵列，从而实现多重靶向（Konermann 等人，2018 年）。随后对 CasRx 的研究表明，在各种动物模型中可以有效地敲低信使 RNA (mRNA)，并在植物中实现转基因表达（Mahas 等人，2019 年；Kushawah 等人，2020 年）。值得注意的是，使用 AAV 载体在新生血管性年龄相关性黄斑变性 (nAMD) 小鼠模型中证明了 CRISPR/CasRx 的治疗潜力。 CRISPR/CasRx 系统的递送成功抑制了血管内皮生长因子 (VEGF) 的 mRNA，这是致病性眼部血管生成的关键因素，并且随后显示出脉络膜新生血管 (CNV) 面积的减少，这是 nAMD 的标志 ( Zhou et al., 2020 )。这些研究表明 CRISPR/CasRx 系统的治疗潜力。在这里，我们描述了三种不同的方法来有效地进行 CRISPR/CasRx 介导的血管内皮生长因子 A (VEGFA) 的 RNA 敲低。我们通过靶向 VEGFA mRNA，使用不同形式的单向导 RNA (sgRNA) 检查了 CRISPR/CasRx 系统的 RNA 敲低效率。为了应用于治疗学开发，我们生成了由 CasRx 和单个前 sgRNA 或多个前 sgRNA（阵列）组成的一体化 AAV 构建体，以检查系统的 RNA 敲除效率。本文介绍了使用 CasRx 和向导 RNA 变体进行体外 RNA 编辑的指导手册。