如果您的样本产生了强劲的阳性结果,则数据解释不需要内部提取控制,并且可以忽略。如果您的样品产生了负结果,则内部提取控制对于解释结果很有用。内部提取控制中的CQ值会根据样品中的DNA量而有所不同。晚期信号(CQ> 28)表明您的样品中只有少量的宿主衍生DNA。您可能希望重复样本收集,然后重复测试以确认负面结果。
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图3。用PHA,CONA或LPS刺激后,基因(RNA)与蛋白质表达的相关性与蛋白质表达的相关性。在刺激后12、24和48小时,ENA(CXCL5),GRO-ALPHA(CXCL1),MCP-3(CCL7)和BLC(CXCL13)的相对RNA和蛋白质表达。将Quantigene plex人免疫反应面板80-plex数据(线图)标准化为管家PPIB。使用Procartaplex人免疫反应面板80-plex获取蛋白质数据。数据(条形图)显示为log2折叠在未刺激的控制样本上的变化。
引言伊朗的穆斯林人口众多,在穆斯林社区最高的国家中排名全球。因此,对清真饮食法规的观察是对穆斯林的基本义务,他们将某些食品(例如猪衍生的食物)标记为非HALAL(HARAM) - 可用于消费(1)。因此,在穆斯林人口众多的国家(例如伊朗)(2)中,清真食品的可用性是一个关键问题。肉被认为是伊朗蛋白质的主要来源,家禽和牛肉是最受欢迎的品种(3)。由伊朗农业部宣布,在2024年,每个居民的家禽肉和红肉的平均消费分别为27公斤和14公斤。随着几种加工过的家禽产品,例如香肠,掘金,鸡肉和牛肉肉丸以及肉牙线,始终有可能在加工过程中将清真肉类产品混合在一起(4)。值得注意的是,在许多可用的产品中,清真肉(例如牛肉和羔羊)更容易通过
CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种免疫机制,可特异性识别和降解外源核酸,从基因上保护生物体 [1]。CRISPR-Cas 系统的功能分为用于靶核酸识别的向导 RNA (gRNA) 和用于切割的 Cas 核酸酶 [1]。该模块化系统通过修改 gRNA 上的靶标识别序列 (TRS) 来切割所需的核苷酸序列 [2],从而实现跨各种生物体(包括微生物)的基因组编辑 [3, 4]。第 2 类 CRISPR-Cas 系统具有单个效应蛋白,主要用于基因组编辑。值得注意的是,大量研究集中在源自化脓性链球菌 (SpCas9) 的 Cas9 [5]。然而,Cas9 蛋白的异源表达可能导致细胞毒性或异常生长 [6, 7]。因此,内源性 CRISPR-Cas 系统 [8]、Cas9 直系同源物 [9] 和 Cas12 或 Cas13 [10] 被用作编辑工具,以提供与靶细胞更好的兼容性。此外,广泛使用的 SpCas9 的尺寸较大(4.1 kb;1,368 aa),这带来了挑战,特别是在包装到空间有限的病毒载体中时 [11]。微型 CRISPR-Cas12f1 系统因其解决这一挑战的潜力而备受关注。Cas12f1 直系同源物由约 500 aa 的单个多肽组成,这比 Cas9 的长度短得多 [12]。已知 Cas12f1 核酸酶形成二聚体,每个单个 RuvC 结构域切割靶 DNA 的两条链 [13, 14]。 Cas12f1 核酸酶在基因组中用于单基因编辑已被报道在多种生物体中,包括大肠杆菌 [15, 16]、炭疽芽孢杆菌 [17]、肺炎克雷伯菌 [18]、小鼠 [19] 和人类 [20, 21]。最近,在天蓝色链霉菌中证实了 Cas12f1 介导的两个基因同时缺失 [22]。然而,Cas12f1 在精确的多重基因组编辑中的应用尚未有记录。在本研究中,我们尝试使用 CRISPR-Cas12f1 系统在大肠杆菌中进行单核苷酸水平的多重基因组编辑。采用了两种策略——调节细胞恢复温度和修改 gRNA,并评估了它们对多重基因组编辑效率和准确性的影响。
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证(未经同行评审证明)获得的是作者/资助者,他授予Biorxiv授予Biorxiv的许可,以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人,该版本发布于2025年2月17日。 https://doi.org/10.1101/2025.02.12.12.637574 doi:Biorxiv Preprint
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可,根据未经同行评审认证)是作者/资助者,他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者(此版本于 2023 年 7 月 30 日发布。;https://doi.org/10.1101/2023.07.27.550902 doi:bioRxiv 预印本
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可,根据 提供(未经同行评审认证)是作者/资助者,他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 8 月 23 日发布。;https://doi.org/10.1101/2022.08.22.504755 doi:bioRxiv 预印本
在没有靶标切割的情况下,催化失活的 dCas9 通过在空间上阻止 CRISPR (cr)RNA 指向的给定基因上的 RNA 聚合酶活性来施加转录基因抑制。这种基因沉默技术称为 CRISPR 干扰 (CRISPRi),已用于各种细菌物种以检测基因,主要是单独或成对检测。在这里,我们在病原体 Legionella pneumophila 中开发了一个多路复用 CRISPRi 平台,能够同时沉默多达十个基因。通过将强进行性启动子与重复/间隔序列上游的 boxA 元素相结合,克服了 Rho 依赖性转录终止对前体 crRNA 表达的限制。使用针对毒力蛋白编码基因的 crRNA,我们证明 CRISPRi 不仅在无菌培养基中生长期间完全发挥作用,而且在巨噬细胞感染期间也完全发挥作用,并且 CRISPRi 的基因耗竭完全重现了缺失菌株的生长缺陷。重要的是,通过改变重复/间隔序列中 crRNA 编码间隔序列的位置,我们的平台实现了目标的逐渐消耗,这反映在表型的严重性上。因此,多重 CRISPRi 有望用于大量探测大量基因,以破译 L. pneumophila 和其他细菌病原体的毒力策略。
基于 CRISPR 的基因激活 (CRISPRa) 是一种通过以组织/细胞类型特异性的方式靶向启动子或增强子来上调基因表达的策略。在这里,我们描述了一个实验框架,该框架将高度多路复用的扰动与单细胞 RNA 测序 (sc-RNA-seq) 相结合,以识别细胞类型特异性、CRISPRa 响应的顺式调控元件及其调控的基因。将许多 gRNA 的随机组合引入许多细胞中的每一个,然后对其进行分析并分成测试组和对照组,以测试 CRISPRa 对增强子和启动子的扰动对邻近基因表达的影响。将该方法应用于 493 个 gRNA 文库,这些 gRNA 靶向 K562 细胞和 iPSC 衍生的兴奋性神经元中的候选顺式调控元件,我们识别出能够特异性上调预期靶基因且 1 Mb 内没有其他邻近基因的 gRNA,包括导致神经元中六种自闭症谱系障碍 (ASD) 和神经发育障碍 (NDD) 风险基因上调的 gRNA。一致的模式是,单个增强子对 CRISPRa 的响应受细胞类型的限制,这意味着成功激活基因依赖于染色质景观和/或其他反式因子。本文概述的方法可能有助于大规模筛选以细胞类型特异性方式激活基因的 gRNA。