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CRISPR/Cas 论文模型：蜗牛壳卷曲
Cas9 切割的位置由与 Cas 蛋白结合的短 RNA 分子（称为向导 RNA）决定（图 1）。向导 RNA 与 Cas9 结合后，复合物扫描基因组以查找称为 PAM 的三碱基序列。Cas9 PAM 序列为 5' NGG 3'，其中 N 可以是任何碱基。当 Cas9 遇到 PAM 序列时，它会解开 DNA，将其分离成单链。然后，Cas9 使用向导 RNA 来确定是否切割 DNA。向导 RNA 的一端有约 20 个碱基，它们决定了 Cas9 将切割哪个 DNA 序列。如果向导 RNA 中这约 20 个碱基的序列与 DNA 互补，则 Cas9 将切割 DNA 的两条链。如果向导 RNA 与 DNA 不匹配，则复合物将移动到下一个 PAM 位点，双螺旋将重新拉上拉链，变成双链形式。使用 Cas9 作为基因编辑工具的诀窍是，科学家可以定制这个约 20 个碱基的序列，将 Cas9 定位到 DNA 的特定区域，基本上允许他们对 Cas9 的切割位置进行编程。
CRISPR/Cas 论文模型：蜗牛壳卷曲
Cas9 切割的位置由与 Cas 蛋白结合的短 RNA 分子（称为向导 RNA）决定（图 1）。向导 RNA 与 Cas9 结合后，复合物扫描基因组以查找称为 PAM 的三碱基序列。Cas9 PAM 序列为 5' NGG 3'，其中 N 可以是任何碱基。当 Cas9 遇到 PAM 序列时，它会解开 DNA，将其分离成单链。然后，Cas9 使用向导 RNA 来确定是否切割 DNA。向导 RNA 的一端有约 20 个碱基，它们决定了 Cas9 将切割哪个 DNA 序列。如果向导 RNA 中这约 20 个碱基的序列与 DNA 互补，则 Cas9 将切割 DNA 的两条链。如果向导 RNA 与 DNA 不匹配，则复合物将移动到下一个 PAM 位点，双螺旋将重新拉上拉链，变成双链形式。使用 Cas9 作为基因编辑工具的诀窍是，科学家可以定制这个约 20 个碱基的序列，将 Cas9 定位到 DNA 的特定区域，基本上允许他们对 Cas9 的切割位置进行编程。
DDX3X 的饱和基因组编辑阐明了生殖系和体细胞变异的致病性
图 1 实验设计 A) 对于每个外显子，在 5' 和 3' 端设计两个独立的 sgRNA 和相关的 HDR 变体文库。B) 将 sgRNA 和 HDR 变体文库一起转染到表达 LIG4 -KO Cas9 的 HAP1 细胞中。sgRNA 指导 Cas9 介导的双链 DNA 切割到目标外显子。HDR 利用质粒文库作为修复模板，将单个感兴趣的 DDX3X 变体整合到每个细胞的内源位点中。每个供体模板还携带 1-3 个 NGG PAM 位点和原型间隔物的同义变化，防止重新切割。由于 DDX3X 是必需的，消除基因功能的变体会导致这些细胞死亡。我们在第 4、7、11、15 和 21 天对细胞进行取样，并对基因组 DNA 进行深度测序以量化变体的丰度。我们预计功能性错义（紫色）和同义变体（Syn，蓝色）仍然丰富，而功能丧失变体（LOF，红色）和有害错义（黄色）变体将从培养物中耗尽。
CRISPR/Cas论文模型：镰状细胞基因治疗
Cas9 切割的位置由与 Cas 蛋白结合的短 RNA 分子（称为向导 RNA）决定（图 5）。向导 RNA 与 Cas9 结合后，复合物扫描基因组以查找称为 PAM 的三碱基序列。Cas9 PAM 序列为 5' NGG 3'，其中 N 可以是任何碱基。当 Cas9 遇到 PAM 序列时，它会解开 DNA，将其分离成单链。然后，Cas9 使用向导 RNA 来确定是否切割 DNA。向导 RNA 的一端有约 20 个碱基，它们决定了 Cas9 将切割哪个 DNA 序列。如果向导 RNA 中这约 20 个碱基的序列与 DNA 互补，则 Cas9 将切割 DNA 的两条链。如果向导 RNA 与 DNA 不匹配，则复合物将移动到下一个 PAM 位点，双螺旋将重新拉上拉链，形成双链形式。使用 Cas9 作为基因编辑工具的诀窍是，科学家可以定制这个约 20 个碱基的序列，将 Cas9 定位到 DNA 的特定区域，基本上允许他们对 Cas9 的切割位置进行编程。
CRISPR/CAS纸模型：镰状细胞基因疗法
其中cas9将切割的地方由称为指导RNA的短RNA分子确定，该指南RNA与CAS蛋白结合（图5）。引导RNA与Cas9结合后，该复合物将基因组扫描为一个称为PAM的三个碱基序列。cas9 pam序列为5'ngg 3'，其中n可以是任何碱基。当Cas9遇到PAM序列时，它会解压缩DNA，将其分成单链。cas9使用引导RNA确定是否切割DNA。在引导RNA的一端是约20个碱基，确定将切割哪种DNA序列Cas9。如果引导RNA中的20个碱基序列与DNA互补，则CAS9将切割DNA的两个链。如果引导RNA与DNA不匹配，则该复合物将移至下一个PAM位点，并且双螺旋将重新拉链为双链形式。将Cas9用作基因编辑工具的诀窍是，科学家可以自定义这个〜20个基本序列，以将Cas9靶向DNA的特定区域，从而基本上允许它们编程CAS9可以切割的地方。
利用 All-in-One 和 HITI CRISPR 技术在中国仓鼠卵巢细胞系中进行多重基因组编辑
简介 在哺乳动物细胞系中产生有利的基因组特征是基因功能研究极为宝贵的策略之一。1,2 基因组编辑主要通过使用传统方法进行，例如 RNA 干扰 3,4 和同源重组。然而，除了染色体 DNA 的自发裂解之外，所需突变体的频率低和特异性低导致了位点特异性核酸酶的发明。最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统为在特定基因组位点快速有效地进行基因编辑打开了一扇有希望的窗口。5,6 CRISPR/Cas9 系统由两个组件组成：向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白的核酸酶活性可在任何被 gRNA 识别的基因组区域中诱导 DNA 双链断裂 (DSB)。该 gRNA 必须伴随目标基因座中相邻的原间隔基序 (PAM) 序列。7,8 NGG 是化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的 PAM 序列，是最
croft-seq
图1。Croft-seq的示意图。（a）具有gDNA（橙色）的链球菌Cas9的示意图，与距离dsDNA（绿色）结合，其中包含与NGG PAM序列（黄色）近端的错配（红色）。（b）Croft-Seq工作流的简化示意图。人类基因组DNA在用Cas9核酸酶消化之前用磷酸酶处理。将所得的DNA末端选择性地绑扎到生物素化衔接子上。然后除去适配器的过量，然后将连接的DNA富含磁珠富集。除去互补的非生物素化DNA链，并合成新的第二个DNA链。所得的DNA从珠子中释放出来，并通过PCR扩增进行测序。（c）Croft-seq生物信息学分析的工作流程。成对末端读数，测序和清洁残留适配器序列，首先与参考基因组保持一致。对齐的读数，该脚本使用4 bp读取窗口搜索陡峭的读取深度变化，并优先考虑潜在的脱离目标脱离靶向的读数和目标序列相似性的双向。只有靶向位置
使用API Mellifera中的集成基因编辑系统扩展CRISPR靶向位点
简单摘要：一种多功能基因操纵工具CRISPR/CAS9已被利用用于蜜蜂的靶向基因组工程。但是，到目前为止，仅证明已证明NGG识别的SPCAS9可以操纵A. Mellifera中的基因组，从而将可编辑的范围限制为NGG-包括基因座。在当前的研究中，为了评估使用CPF1，SPCAS9和SACAS9时的潜在扩展，我们通过生物信息学方法预测了整个Honeybee基因组中靶向位点的分布和数量。生物信息学分析的结果表明，A。Mellifera中可访问的目标位点的数量可以通过集成的CRISPR系统大大增加。此外，我们测量了这些新的CRISPR酶在Mellifera中的裂解活性，发现SACAS9和CPF1都可以诱导Mellifera中的基因组交替，尽管CPF1的诱变速率相对较低，而Sacas9的不稳定编辑速率相对较低。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。 综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。
CRISPR/Cas9 基因组编辑
实验室中使用的 Cas9 ， PAM 序列是 NGG（其中 N 表示四种碱基中的任意一种）。PAM 序列被 Cas9 识别，然后与 PAM 序列结合。Cas9 检查结合的 gRNA 和 DNA 链之间是否存在碱基配对互补。如果发现配对互补，则在 PAM 序列 3' 端上游 3 个碱基对的位置进行钝性双链切割。双链 DNA 切割完成后，细胞有两种方式修复损伤，称为非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR)。其中 NHEJ 速度更快，但比 HDR 更容易发生错误。NHEJ 修复由细胞执行，以修复导致在 DNA 链断裂处插入核苷酸的损伤。这表明由于某些细胞的 DNA 永久受损，因此表达了突变的非功能性基因。这也意味着，利用CRISPR/Cas9技术为大量细胞制造DNA双链断裂，目标基因将发生损伤错误修复和功能突变永久丧失，从而实现研究人员快速高效去除或删除基因的目的。
2021年6月 - 全球项目债券市场...
22/01/2021 2i rete Gas Spa IT BAW2 BBB 2031 500 0,579％71,08 0,81 12/01/2021 E.ON E.ON AD AD BE BO2 BBB 2028 600 0,100 09/01/2020 e.on ed bod baw2 bbb 2030 500 0,750％42,16 0,49 31/10/2019 e.on e.on ses，弓Vercko oyj for BBB+ 2027 500 0,375％52,37 0,31 10/10/2019 Enel Finance Intl NV Energias ePoltugal SA PT BAW3 BBB 2027 750 1,625％46,01 0,26 13/01/2020 Energias Drortugal SAPT B2 BB+ 2080 70 1,700％183,34 750 700％183,34 750 1,700％183,38， 20/03/2020 ENGIE SA FR BAW1 BBB+ 2028 750 1,750％34,29 0,21 16/01/2020任何SPA IT BAU1 A-2030 1 1 1 00 BAW1 A- 2034 750 1,000％50,86 0,82 01/04/2020 IBERDROLE FINANZAS SAU ES BAW1 BB1 BB+ 2025 750 0,875％22,32 -0,12 0 0/02/02/209 BB+ 2033 500 0,500％67,50 0,90 02/12/2019 Italgas Spa IT BAR2 BBB+ 2031 500 1,000％64,99 0,80 2025 500 0,190％33,25 -0,04 06/04/2020 Naturgy Finance BV NL BBB（Fitch）BBB BB- 2082 750 2,125％206,01 1,89 28/08/2019 NGG Fince Plc UK BA1 BBB-2079 500 1,625％1,625％161,46 1,24 09/09/01/01/01/2020 （Fitch）A- 2028 700 0,375％23,40 0,13 20/09/2018 RTE RESEER DE TRANCEPORT FR NR NR NR NR NR NR NR NR，500 2,125％51,53 NR IS 2030 500 1,500％37,04 0,43 27/11/2019 Servis Madio Ambiente ES NR BBB-（Fitch）2026 500 1,661％78,14 0,56 05/09/09/201％ 2034 600 1,000％63,69 0,93 26/03/2020 Suez FR BAR1 2027 850 1,250％34,01 0,14