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CRISPR 筛选：研究病毒的分子工具——...
病毒是专性病原体，利用宿主细胞机制进行复制。宿主细胞可以识别病毒并激活抗病毒反应。揭示影响病毒感染的因素有助于发现新的候选药物。使用有助于抗病毒免疫反应的特异性免疫激动剂是治疗感染的另一种方法。最近，使用新的综合分子工具（例如成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 筛选）研究宿主细胞相互作用并确定开发新抗病毒药物的关键靶标已成为可能。在过去十年中，CRISPR/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 系统已被用于基因组编辑。仅当基因组靶标后面跟着一个原间隔区相邻基序 (PAM) 序列（Cas9 蛋白为 NGG，Cas12a 蛋白为 TTTV）时，Cas 蛋白才会使用 II 型 CRISPR 系统中的单向导 RNA (sgRNA) 和 V 型系统中的 CRISPR RNA (crRNA)（为简单起见，在本综述中称为 gRNA）识别靶位点。在识别靶位点后，Cas 蛋白会解开 DNA 链，形成 R 环结构，并切断两条链，导致 DNA 双链断裂 (DSB)。利用位点特异性诱变，已经生成了具有核酸酶钝结构域的 Cas 内切酶变体，称为核酸酶失活 Cas (dCas) 蛋白。dCas 保留了结合目标位点的能力，但不能将 DSB 引入 DNA。将不同的功能域融合到 dCas 蛋白上，可将其转化为具有多种功能的分子“瑞士军刀”，例如单核苷酸编辑和调节转录和表观遗传学 [1]。通过不同的 CRISPR/Cas 系统激活或抑制靶基因转录已被广泛用于破坏单个基因和研究病毒-宿主相互作用 [2]。通过设计和合成数千个针对多个目标基因或基因组中所有基因的 gRNA，可以使用 CRISPR/Cas
基准
CRISPR/Cas9 系统天然存在于细菌和古细菌免疫系统中 [ 1 ] ；然而，它已被改造用于真核生物，成为获得诺贝尔奖的基因组编辑系统 [ 2,3 ] 。CRISPR/Cas9 系统使用 gRNA 将 Cas9 核酸酶引导至 NGG 原型间隔区相邻基序序列附近的特定靶标。然后，Cas9 切割 DNA，细胞的天然 DNA 损伤修复机制修复双链断裂。在 CRISPR/Cas9 编辑过程中，用于敲除和修饰靶基因的两种主要修复途径是非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复途径。当供体 DNA 模板不可用时，NHEJ 是修复双链断裂的主要选择，这使其成为 CRIPSR/Cas9 敲除实验的一个不错选择。核苷酸的丢失和获得是 NHEJ 介导的修复过程中的常见现象，而敲除则来自编码序列的移动。同源定向修复基于供体 DNA 模板的可用性，主要用于编码或非编码序列中的定制基因修饰 [4,5]。CRISPR/Cas9 系统越来越多地用于高级疗法，包括细胞和基因疗法，前景广阔（例如，用于治疗镰状细胞病的 CRISPR 测试）[6,7]。许多用于实现 CRISPR/Cas9 核酸酶 RNA 引导的基因组编辑的商业产品可通过多种递送方式获得。这些产品包括病毒、质粒、mRNA 和 RNP 中编码的 DNA。此外，CRISPR gRNA 可以分为两部分递送，即 crRNA 和 tracrRNA，或作为 sgRNA。多种细菌物种提供 CAS 蛋白选择；常用的一种是化脓性链球菌 Cas9。同样，这些分子进入细胞的方式也有很多，包括病毒载体（如慢病毒和腺相关病毒载体）和化学方法（如脂质、注射和电穿孔）[8,9]。尽管 CRISPR/Cas9 是一种令人兴奋的基因组编辑工具，但在使用 CRISPR/Cas9 编辑细胞后，关于基因组和表型稳定性的纵向数据有限。目前有几份报告提供的证据表明，CRISPR/Cas9 编辑还可能带来其他意想不到的长期变化[10–12]。此外，在选择编辑的细胞亚群时可能会出现遗传瓶颈。因此，对用于细胞和基因疗法等高级疗法的编辑细胞进行表征至关重要，因为这种疗法通常涉及给患者施用编辑过的细胞群[13]。
使用新型 Lb Cas12a 变体对大麦进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响 Tom Lawrenson、Alison Hinchliffe、Macarena
CRISPR、Cas12a、CPF1、大麦、诱变、单子叶植物、基因组编辑摘要我们报告了首次成功、高效使用大麦中的 Lb Cas12a，并描述了两种新型 Cas12a 变体的开发和应用。总共我们使用二十种不同的指南比较了五种编码序列 (CDS) 变体，包括两种新型变体和两种指南架构，针对 5 种不同的靶基因。我们发现不同 CDS 版本 (0-87%) 和指南架构 (0-70%) 之间的编辑效率存在很大差异，并且表明我们的两个新型 CDS 版本在该物种的测试中大大优于其他版本。我们展示了产生的突变的遗传性。我们的研究结果强调了优化单个物种的 CRISPR 系统的重要性，并可能有助于在其他单子叶植物中使用 Lb Cas12a。正文 毛螺菌科细菌 Cas12a (Lb Cas12a) 可能是继化脓性链球菌 Cas9 (Sp Cas9) 之后植物基因组编辑中第二广泛使用的可编程核酸酶，并且具有一些潜在优势。首先，由于其对 TTTV PAM 的要求与 NGG 的 Sp Cas9 要求不同，它可用于 GC 沙漠，而 GC 沙漠通常存在于内含子、UTR 和启动子区域中。其次，Lb Cas12a 通常比 Sp Cas9 产生更大的缺失，这可能在缺失研究中有用。第三，虽然 Sp Cas9 在靶标的 PAM 近端切割产生平端，但 Lb Cas12a 在 PAM 远端区域切割产生粘端；这两个特征可能解释了使用 Lb Cas12a 实现的基因靶向发生率更高 (Wolter 和 Puchta，2019)。已知在植物中起作用的三种版本的 Lb Cas12a 针对一个大麦靶标进行了测试。首先，是水稻优化的编码序列 (CDS) (Os Cas12a) (Tang et al., 2017)；其次是人类优化的 CDS (Hs Cas12a)，在双子叶植物中具有功能 (Bernabé-Orts et al., 2019)；第三是拟南芥优化的 CDS，包含 D156R“耐高温”突变 (tt At Cas12a) (Schindele and Puchta, 2020)。我们还创建了两个新版本，携带 D156R 突变的 Hs Cas12a (tt Hs Cas12a) 和携带 8 个内含子的 tt At Cas12 (tt At Cas12+int)。这些内含子之前曾显著提高过 Sp Cas9 的效率（Grutzner 2021），因此我们使用相同的在线工具（NetGene2 - 2.42 - Services - DTU Health Tech）在我们的 tt At Cas12+int 设计中为拟南芥选项获得了较高的剪接置信度。
短文 - 矢千绘望 CV
（Yachie N 是 + 第一和/或 * 通讯作者）基因组编辑：在 CRISPR-Cas9 基因组编辑中，向导 RNA 将 Cas9 募集到与原间隔区相邻基序 (PAM) 序列 5'-NGG-3' 相邻的目标基因组区域，然后 Cas9 产生 DNA 双链断裂 (DSB)。该事件通过诱导不同的 DNA 修复途径促进基因缺失或转基因插入，但 DSB 具有细胞毒性，并且基于 DSB 的编辑结果不可预测。我们与 Keiji Nishida 博士合作开发了一种新的基因组编辑工具 Target-AID，它将胞苷脱氨酶 (AID) 融合到切口酶 Cas9 上，并实现了高度精确的靶向 C→T 替换，而无需 DSB [Science 2016]。我们还与 Osamu Nureki 博士合作，成功将 Cas9 的靶向范围从限制性 NGG 扩展到 NG PAM（Cas9-NG），并开发了 Target-AID-NG [ Science 2018] 。此外，我的团队开发了一种新的碱基编辑器 Target-ACEmax，它能够在目标 DNA 分子上同时诱导 C→T 和 A→G 替换，极大地扩展了碱基编辑在治疗和生物技术开发中的潜力 [ Nature Biotechnology 2020*] 。我们还为由 Atsushi Hoshino 博士和 Osamu Nureki 博士领导的基于 Cas12f 的紧凑型基因组编辑工具的开发做出了贡献 [ Cell 2023] 。此外，为了探索除 CRIPSR-Cas9 和其他已表征的基因组编辑工具之外的新基因组编辑工具，我们开发了一种工具，可以从基因组和宏基因组资源中快速捕获周期性和间隔周期性重复序列 [ Nucleic Acids Research 2019*]。细胞谱系追踪：已提出了几种方法来追踪多细胞生物的发育细胞谱系，其中嵌入染色体的 DNA 条形码通过 Cas9 不断突变并从母细胞遗传到子细胞，可以根据观察时的突变模式重建谱系。然而，这些技术都没有实现高分辨率的谱系追踪。为了在单细胞分辨率下破译哺乳动物（小鼠）全身发育过程的图谱，我的团队概述了该领域的关键问题和观点 [Science 2022*]，并正在开发新的基因回路、小鼠工程和高性能计算技术。上述 Target-AID 和 Target-ACEmax 主要用于高分辨率细胞谱系追踪。我们还开发了一种新的深度分布式计算平台，并成功对模拟器生成的超过 2.35 亿个突变序列进行了精确的谱系重建 [Nature Biotechnology 2022*]。回顾性克隆分离：“化疗抗性克隆是否从一开始就存在于具有独特细胞状态的初始细胞群中？”或“观察到的干细胞分化命运背后是否有任何分子因素？”等问题突出了许多尚未解决的生物学问题。如果可以从初始细胞群中分离出在细胞进展后期表现出特定表型的克隆，则可以解决这些问题。最近出现了“回顾性克隆分离”这一新概念来解决上述问题。首先在这样的系统中繁殖条形码细胞群，然后对其亚群进行给定的测定。在识别出感兴趣的条形码克隆后，以条形码特定的方式从初始或实验期间存储的任何其他亚群中分离出相同的克隆（或其近亲）。然后可以对分离的活克隆进行任何后续实验，包括组学测量和用分离物重建合成细胞群。我们最近建立了一种使用 CRISPR 碱基编辑的高性能回顾性分离技术 CloneSelect [ bioRxiv 2022*]。我们已经证明 CloneSelect 适用于人类癌细胞系、人类多能干细胞、小鼠干细胞、酵母细胞和大肠杆菌细胞。细胞网络：癌症和人类疾病通常由复杂的细胞网络介导。我们已经证明，涉及破坏蛋白质相互作用的基因组突变在癌症和其他人类疾病中高度富集 [ Cell 2015]。此外，通过利用蛋白质编码基因的 DNA 分子标记和大规模并行 DNA 测序，我们开发了一种新的高通量蛋白质相互作用技术 BFG-Y2H（条形码融合遗传学-酵母双杂交）。该技术使单个研究人员能够在 2-3 周内筛选至少 250 万个蛋白质对的蛋白质相互作用 [ Molecular Systems Biology 2016+,*]。使用我们已经证明 CloneSelect 适用于人类癌细胞系、人类多能干细胞、小鼠干细胞、酵母细胞和大肠杆菌细胞。细胞网络：癌症和人类疾病通常由复杂的细胞网络介导。我们已经证明，与破坏蛋白质相互作用有关的基因组突变在癌症和其他人类疾病中高度富集 [ Cell 2015] 。此外，通过利用蛋白质编码基因的 DNA 分子标记和大规模并行 DNA 测序，我们开发了一种新的高通量蛋白质相互作用技术 BFG-Y2H（条形码融合遗传学-酵母双杂交）。该技术使单个研究人员能够在 2-3 周内筛选至少 250 万个蛋白质对的蛋白质相互作用 [ Molecular Systems Biology 2016+,*] 。使用我们已经证明 CloneSelect 适用于人类癌细胞系、人类多能干细胞、小鼠干细胞、酵母细胞和大肠杆菌细胞。细胞网络：癌症和人类疾病通常由复杂的细胞网络介导。我们已经证明，与破坏蛋白质相互作用有关的基因组突变在癌症和其他人类疾病中高度富集 [ Cell 2015] 。此外，通过利用蛋白质编码基因的 DNA 分子标记和大规模并行 DNA 测序，我们开发了一种新的高通量蛋白质相互作用技术 BFG-Y2H（条形码融合遗传学-酵母双杂交）。该技术使单个研究人员能够在 2-3 周内筛选至少 250 万个蛋白质对的蛋白质相互作用 [ Molecular Systems Biology 2016+,*] 。使用