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Combi‐CRISPR：NHEJ 和 HDR 的结合提供了……
摘要 CRISPR-Cas9 广泛用于小鼠和大鼠的基因靶向。非同源末端连接 (NHEJ) 修复途径在受精卵中占主导地位，可有效诱导插入或缺失 (indel) 突变，从而在靶位点敲除基因，而通过同源定向修复 (HDR) 的基因敲入 (KI) 则难以产生。在本研究中，我们使用双链 DNA (dsDNA) 供体模板与 Cas9 和两个单向导 RNA，一个用于切割目标基因组序列，另一个用于切割 dsDNA 质粒的侧翼基因组区域和一个同源臂，在 G0 幼崽中产生 20-33% 的 KI 效率。 G0 KI 小鼠在一个靶位点携带 NHEJ 依赖的插入/缺失突变，该突变设计在内含子区域，而在另一个外显子位点携带 HDR 依赖的各种供体盒（例如 EGFP 、mCherry 、Cre 和感兴趣的基因）的精确 KI，这些供体盒的长度从 1 到 5 kbp 不等。这些发现表明，这种由 CRISPR-Cas9 系统介导的 NHEJ 和 HDR 组合方法有助于在小鼠和大鼠中高效、精确地 KI 质粒 DNA 盒。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
MEGA dPCR揭示染色体畸变、NHEJ精确修复、复发性核酸酶切割和DSB半衰期
附加声明：是的，存在潜在的竞争利益。N.W.、A.C.、A.J.T.和 G.T.¦ 领导了 dPCR MEGA 方法的专利申请。M.M.、M.H.P.和 S.S. ¦ 领导了用于增强 HDR 的药物抑制剂的专利申请。这项工作得到了英国威康信托基金会 (217112/Z/19/Z) 的支持。A.J.T.、C.B.、A.C.、G.T.和 G.S.还得到了英国国家健康和护理研究所、大奥蒙德街儿童医院、国家健康服务基金会和伦敦大学学院的生物医学研究中心的支持。A.J.T.是 Orchard Therapeutics、Generation Bio、Carbon Biosciences 和 4BIO Capital 的科学顾问委员会成员。C. Booth 在过去 3 年中为 SOBI 和 Novartis 提供临时咨询服务，并为 SOBI 和 Chiesi 制作教育材料。P.A.、S.W.、C.R.J、G.S.、R.N.、M.M.、G.T.目前受雇于阿斯利康，可能是阿斯利康的股东
通过1 NHEJ缺乏而不是Populus中的HDR因子过表达高效的CRIS介导的同源重组2 3 Ali Movahedi1§
Highly efficient CRISPR-mediated homologous recombination via 1 NHEJ deficiency rather than HDR factors overexpression in Populus 2 3 Ali Movahedi 1§* , Hui Wei 1§ , Zhong-Hua Chen 2 , Weibo Sun 1 , Jiaxin Zhang 3 , Dawei Li 1 , Liming 4 Yang 1* , and Qiang Zhuge 1* 5 6 1 College of Biology and the Environment,中国南部7号的可持续林业共同创新中心，森林遗传学与生物技术主要实验室，教育部，南京林业大学8号，南京210037，210037，9 2霍克斯伯里环境学院，霍克斯伯里环境学院，西悉尼悉尼大学，10佩里斯大学，新南威尔士州佩里斯2751，新南威尔士州2751，澳大利亚11 3 n and NANJ and nanj andial andical Instriciting andical Sciention and nan Junan Junlan andical Instriciting Synormitics Squartring Synormitics Squarnion，NAN NAN NAN NAN NAN SACEITIC 210046，中国13 14 15 *应将信件发送给Qiang Zhuge，Ali Movahedi和Liming Yang：生物学与环境学院16，南部17中国可持续林业中心共同创新中心，中国森林遗传学与生物技术的主要实验室，教育部，Nanjing 18 Forestry University，Nanjing 18 Forestry University，Nanjing University，Nanjing University，Nanjing 210037。电子邮件：qzhuge@njfu.edu.cn; 19 ali_movahedi@njfu.edu.cn; yangliming@njfu.edu.cn;传真：+86 25 85428701 20 21§这些作者同样作为第一作者22 23 22 23 24跑步标题：高效通过XRCC4 Poplar中的XRCC4缺乏效率25 26 26 27 27 27 27 28 29 28 29 30 31 32 33 33 34 35 33 35 36 37 37 38 39 39 38 39 38 39 39 38 39 38 39 38 39 38 39电子邮件：qzhuge@njfu.edu.cn; 19 ali_movahedi@njfu.edu.cn; yangliming@njfu.edu.cn;传真：+86 25 85428701 20 21§这些作者同样作为第一作者22 23 22 23 24跑步标题：高效通过XRCC4 Poplar中的XRCC4缺乏效率25 26 26 27 27 27 27 28 29 28 29 30 31 32 33 33 34 35 33 35 36 37 37 38 39 39 38 39 38 39 39 38 39 38 39 38 39 38 39
分析CRISPR介导的DNA裂解后基于NHEJ的DNA修复
摘要：使用CRISPR-CAS9核酸酶进行基因组编辑是基于DNA双重断裂（DSB）的修复。在真核细胞中，DSB通过同源指导的修复（HDR），非同源末端连接（NHEJ）或微学介导的终端连接（MMEJ）途径重新加入。其中，人们认为NHEJ途径是主导的，并且发生在整个细胞周期中。已知基于NHEJ的DSB维修是错误的；但是，很少有研究深入研究内源基因。在这里，我们通过掺入外源性DNA寡核苷酸来量化基于NHEJ的DSB修复精度（称为NHEJ精度）。通过对DSB发生后的外源性DNA和内源性靶点之间的连接序列的分析，我们确定NHEJ准确性的平均值在HEK 293T细胞中的最大值约为75％。在深入的分析中，我们发现NHEJ的精度依赖于序列，并且DSB端的近端邻近基序（PAM）的值相对较低，低于PAM远端的DSB。此外，我们观察到插入突变比与NHEJ准确性程度之间存在负相关。我们的发现将扩大对CAS9介导的基因组编辑的理解。
将核酸外切酶与 Cas9 融合可增强毕赤酵母中的同源重组
HR 比 NHEJ 慢得多，NHEJ 可以从 DSB 事件中拯救更多细胞。NHEJ 几乎不需要或根本不需要末端切除来直接重新连接 DSB 末端。相比之下，HR 需要短距离切除和长距离切除 DSB 以及供体来实施修复过程。此外，其他蛋白质也可能是 HR 修复途径的限制因素 [18, 19]。我们在此发现，在同时删除两个基因和整合多个片段期间，将 MRE11 与 CAS9 融合可提高 CFU 数量
易于开始使用def-cs媒体！人IPS细胞实验
基因组编辑实验的问题基因组编辑是一种技术，它使用人工设计和创建了序列特异性的DNA降解酶来切割基因组DNA，并改变了基因组上的特定遗传学，例如非同源终端连接（NHEJ）（NHEJ）（NHEJ）（NHEJ）和同源性重组（HR）来替代DNA（unifie of Migral usiral usion fil dna ailtent ulive dna ailtent of dna a）。自2013年使用第三代人造核酸酶进行基因组编辑以来，已经在广泛的领域中研究了基因组编辑技术的使用，包括基础研究，药物发现和再生医学，甚至繁殖农业和牲畜产品。另一方面，为了更有效地进行基因组编辑，每个实验步骤都需要解决各种挑战（图7）。
引用：Yang，W.，Qi，W.，Li，Y.，Wang，J.，Luo，Y.，Ding，D.，Mo，S.，Chen，B.，Lu，Y. （2021）。编程的顺序切割endows
CRISPR/CAS9介导的基因组编辑技术引发了生物学研究的革命（Jinek等，2012）。cas9与指南RNA在精确的位置上切割DNA，并通过包括动物和植物在内的高层真核细胞中的非同源末端连接（NHEJ）途径有效地修复所得的双链断裂（DSB）。由于NHEJ的维修过程是容易出错的，因此结果结果主要是框架之外的事件。因此，CAS9主要被认为是一种高度效力的“敲除”工具，并深深地认为无法在没有重大修改的情况下形成框架基础转换。结果，框架内的基础变化必须依赖于脱氨酶介导的基础编辑器（Komor等，2016; Gaudelli等，2017），主要编辑工具（Anzalone等，2019）或通过同源指导性维修或NHEJ通过供体DNA模板的低效率融合。最近，越来越多的证据表明，NHEJ修复结果是非随机且可预测的（Shen等，2018； Allen等，2018； Chen等，2019）。的确，众所周知，即使在同一切割部位， +1/–1 bp indels也常常主导NHEJ修复结果。我们突然意识到
植物PAXX具有XLF样函数，并刺激了ku -dna连接酶IV/XRCC4复合物的DNA末端
非同源末端连接（NHEJ）在修复DNA双链断裂中起主要作用，并且是基因组稳定性和编辑的关键。最小的核心NHEJ蛋白，即Ku70，Ku80，DNA连接酶IV和XRCC4，但其他因素在不同的真核生物组中有所不同。在植物中，唯一已知的NHEJ蛋白是核心因素，而植物NHEJ的分子机制仍然不清楚。在这里，我们报告了先前未知的PAXX植物直系同源物，其晶体结构显示出与人类“ PAXX”相似的折叠。然而，通过与KU70/80和XRCC4相互作用，植物PAXX具有与人XLF相似的分子函数。这表明植物PAXX结合了哺乳动物PAXX和XLF的作用，并且这些功能在进化过程中合并为单个蛋白质。这与PAXX和XLF在哺乳动物中的重新效力一致。