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MEGA dPCR揭示染色体畸变、NHEJ精确修复、复发性核酸酶切割和DSB半衰期
附加声明：是的，存在潜在的竞争利益。N.W.、A.C.、A.J.T.和 G.T.¦ 领导了 dPCR MEGA 方法的专利申请。M.M.、M.H.P.和 S.S. ¦ 领导了用于增强 HDR 的药物抑制剂的专利申请。这项工作得到了英国威康信托基金会 (217112/Z/19/Z) 的支持。A.J.T.、C.B.、A.C.、G.T.和 G.S.还得到了英国国家健康和护理研究所、大奥蒙德街儿童医院、国家健康服务基金会和伦敦大学学院的生物医学研究中心的支持。A.J.T.是 Orchard Therapeutics、Generation Bio、Carbon Biosciences 和 4BIO Capital 的科学顾问委员会成员。C. Booth 在过去 3 年中为 SOBI 和 Novartis 提供临时咨询服务，并为 SOBI 和 Chiesi 制作教育材料。P.A.、S.W.、C.R.J、G.S.、R.N.、M.M.、G.T.目前受雇于阿斯利康，可能是阿斯利康的股东
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
分析CRISPR介导的DNA裂解后基于NHEJ的DNA修复
摘要：使用CRISPR-CAS9核酸酶进行基因组编辑是基于DNA双重断裂（DSB）的修复。在真核细胞中，DSB通过同源指导的修复（HDR），非同源末端连接（NHEJ）或微学介导的终端连接（MMEJ）途径重新加入。其中，人们认为NHEJ途径是主导的，并且发生在整个细胞周期中。已知基于NHEJ的DSB维修是错误的；但是，很少有研究深入研究内源基因。在这里，我们通过掺入外源性DNA寡核苷酸来量化基于NHEJ的DSB修复精度（称为NHEJ精度）。通过对DSB发生后的外源性DNA和内源性靶点之间的连接序列的分析，我们确定NHEJ准确性的平均值在HEK 293T细胞中的最大值约为75％。在深入的分析中，我们发现NHEJ的精度依赖于序列，并且DSB端的近端邻近基序（PAM）的值相对较低，低于PAM远端的DSB。此外，我们观察到插入突变比与NHEJ准确性程度之间存在负相关。我们的发现将扩大对CAS9介导的基因组编辑的理解。
通过1 NHEJ缺乏而不是Populus中的HDR因子过表达高效的CRIS介导的同源重组2 3 Ali Movahedi1§
Highly efficient CRISPR-mediated homologous recombination via 1 NHEJ deficiency rather than HDR factors overexpression in Populus 2 3 Ali Movahedi 1§* , Hui Wei 1§ , Zhong-Hua Chen 2 , Weibo Sun 1 , Jiaxin Zhang 3 , Dawei Li 1 , Liming 4 Yang 1* , and Qiang Zhuge 1* 5 6 1 College of Biology and the Environment,中国南部7号的可持续林业共同创新中心，森林遗传学与生物技术主要实验室，教育部，南京林业大学8号，南京210037，210037，9 2霍克斯伯里环境学院，霍克斯伯里环境学院，西悉尼悉尼大学，10佩里斯大学，新南威尔士州佩里斯2751，新南威尔士州2751，澳大利亚11 3 n and NANJ and nanj andial andical Instriciting andical Sciention and nan Junan Junlan andical Instriciting Synormitics Squartring Synormitics Squarnion，NAN NAN NAN NAN NAN SACEITIC 210046，中国13 14 15 *应将信件发送给Qiang Zhuge，Ali Movahedi和Liming Yang：生物学与环境学院16，南部17中国可持续林业中心共同创新中心，中国森林遗传学与生物技术的主要实验室，教育部，Nanjing 18 Forestry University，Nanjing 18 Forestry University，Nanjing University，Nanjing University，Nanjing 210037。电子邮件：qzhuge@njfu.edu.cn; 19 ali_movahedi@njfu.edu.cn; yangliming@njfu.edu.cn;传真：+86 25 85428701 20 21§这些作者同样作为第一作者22 23 22 23 24跑步标题：高效通过XRCC4 Poplar中的XRCC4缺乏效率25 26 26 27 27 27 27 28 29 28 29 30 31 32 33 33 34 35 33 35 36 37 37 38 39 39 38 39 38 39 39 38 39 38 39 38 39 38 39电子邮件：qzhuge@njfu.edu.cn; 19 ali_movahedi@njfu.edu.cn; yangliming@njfu.edu.cn;传真：+86 25 85428701 20 21§这些作者同样作为第一作者22 23 22 23 24跑步标题：高效通过XRCC4 Poplar中的XRCC4缺乏效率25 26 26 27 27 27 27 28 29 28 29 30 31 32 33 33 34 35 33 35 36 37 37 38 39 39 38 39 38 39 39 38 39 38 39 38 39 38 39
Combi‐CRISPR：NHEJ 和 HDR 的结合提供了……
摘要 CRISPR-Cas9 广泛用于小鼠和大鼠的基因靶向。非同源末端连接 (NHEJ) 修复途径在受精卵中占主导地位，可有效诱导插入或缺失 (indel) 突变，从而在靶位点敲除基因，而通过同源定向修复 (HDR) 的基因敲入 (KI) 则难以产生。在本研究中，我们使用双链 DNA (dsDNA) 供体模板与 Cas9 和两个单向导 RNA，一个用于切割目标基因组序列，另一个用于切割 dsDNA 质粒的侧翼基因组区域和一个同源臂，在 G0 幼崽中产生 20-33% 的 KI 效率。 G0 KI 小鼠在一个靶位点携带 NHEJ 依赖的插入/缺失突变，该突变设计在内含子区域，而在另一个外显子位点携带 HDR 依赖的各种供体盒（例如 EGFP 、mCherry 、Cre 和感兴趣的基因）的精确 KI，这些供体盒的长度从 1 到 5 kbp 不等。这些发现表明，这种由 CRISPR-Cas9 系统介导的 NHEJ 和 HDR 组合方法有助于在小鼠和大鼠中高效、精确地 KI 质粒 DNA 盒。