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DNA双链破裂修复蛋白的依赖性
DNA双链断裂通过多种途径修复，包括非同源最终连接（NHEJ）和微学介导的端连接（MMEJ）。这些途径的平衡取决于局部染色质的环境，但是对基本机制的理解很少。通过将敲除筛选与双重MMEJ：NHEJ报告基因插入在19种不同的染色质环境中，我们识别了数十种DNA修复蛋白，这些DNA修复蛋白调节途径取决于局部染色质状态。偏爱NHEJ的蛋白质主要与斑塑素协同作用，而有利于MMEJ的蛋白通常与不同类型的异染色质协同作用。前者的例子是BRCA2和民意调查，后者是幻想综合体和ATM。此外，在各种人类癌症类型中，其中几种蛋白质的丧失改变了杂染色质和全染色质之间途径特异性突变的分布。一起，这些结果发现了一个复杂的蛋白质网络，该蛋白质以染色质上下文与依赖性方式调节MMEJ：NHEJ平衡。
crispr cas9
NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，经常导致核苷酸（Indels）的小插入或缺失到DSB位置。由NHEJ介导的DSB修复的随机性具有重要的实际意义，因为表达Cas9和ARNG的细胞群将导致广泛的突变。在大多数情况下，NHEJ在靶DNA中产生了小散析，从而导致氨基酸框架中的缺失，插入或突变导致靶向基因的开放式读数（ORF）中的过早终止密码子。理想的最终结果是突变，靶向基因的功能损失。但是，必须通过实验验证给定突变细胞的“敲除”表型的强度。
利用 CRISPR/Cas9 系统寻找新型重组修复增强子
研究成果概要（中文）：CRISPR-Cas9 是一种多功能技术，可应用于医疗。在 DNA 双链断裂后的修复途径中，与模板 DNA 同源重组 (HDR) 的修复有助于精确编辑，但同时，涉及碱基缺失或插入的 NHEJ 也以高频率发生。我使用 Traffic Light Reporter 系统进行了基于细胞的 HDR 增强因子筛选，该系统可以同时检测具有 HDR 和 NHEJ 的细胞，并确定了与 NHEJ 衍生细胞相比，HDR 衍生细胞中表达较高的几个基因。对这些基因的进一步基因本体分析表明，它们与 DNA 修复和细胞周期有关。
鉴定大脑中新的睫状信号通路和对神经系统疾病的见解
两种DNA修复途径，非同源末端连接（NHEJ）和替代末端连接（A-EJ），参与V（d）J重组和染色体易位。先前的研究报告了染色体易位的不同修复机制，NHEJ主要参与小鼠的人类和A-EJ。nhej取决于DNA-PKC，这是突触形成和下游成分激活的关键伴侣。虽然DNA-PKC抑制作用促进了具有小鼠微论的染色体易位，但其在人类中的同义效应尚不清楚。我们发现人类细胞中的部分DNA-PKC抑制会导致易位增加，并持续参与抑制的NHEJ。相比之下，完全增加了微学介导的末端连接（MMEJ），因此完全增加了DNA-PKC，从而弥合了人与小鼠之间的两种不同的易位机制。与先前关于KU70缺失的研究类似，G1/G0相小鼠祖细胞B细胞系中的DNA-PKCS缺失显着损害V（d）J重组，并由于编码失调和信号终端连接而产生了更高的易位速率。遗传DNA-PKC抑制完全抑制了NHEJ的参与，其表型上的修复类似于KU70缺乏的A-EJ。相比之下，我们发现在产生与Lig4缺乏相关的近乎异常的MMEJ时，DNA-PKCS所需的DNA-PKC。我们的研究强调了DNA-PKC抑制非法染色体重排，同时也有助于这两种物种的MMEJ。
响应CRISPR/CAS9引起双重链断的方法，有利于同源指导的维修选择
摘要：精确的基因编辑是 - 或很快就会用于多种疾病的临床用途，并且正在开发更多应用。由单个诱导RNA（SGRNA）导演的可编程核酸酶CAS9可以在基因组DNA的靶位点中引入双链断裂（DSB），这构成了使用这种新技术的基因编辑的初始步骤。在哺乳动物中，两种途径占主导地位的DSB修复 - 非同源末端连接（NHEJ）和同源指导的修复（HDR） - 基因编辑的结果主要取决于这两个修复途径之间的选择。尽管HDR以其高度有吸引力，但在生物学环境中，修复途径的选择是有偏见的。哺乳动物细胞优先通过多种机制利用NHEJ：NHEJ在整个细胞周期中都活跃，而HDR仅限于S / G2阶段； NHEJ比HDR快。 NHEJ抑制了HDR过程。这表明可以通过操纵细胞修复途径的选择来实现对编程DNA病变结果的明确控制。在这篇综述中，我们总结了DSB修复途径，基于DNA切除的选择选择的机制，并在研究策略中取得了进展，该策略基于操纵修复途径的选择以增加哺乳动物细胞的HDR频率，从而有利于Cas9介导的HDR。还讨论了提高HDR效率的其余问题。本评论应促进CRISPR / CAS9技术的开发，以实现更精确的基因编辑。
细胞内递送 CRISPR-Cas9 RNP 以用于医疗应用
• 可以进行DNA编辑的工具 • 由Cas9蛋白和gRNA组成 • gRNA识别并切割目标序列。 • 切割的序列主要通过末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）进行修复 • NHEJ容易发生缺失和突变等错误→适用于基因缺失 • HDR可以根据供体DNA的设计引入所需的序列。
非同源末期基因型，mRNA表达和DNA修复能力
和基因型 - 表型相关性。结果：XRCC4 RS3734091，RS28360071，XRCC5 RS828907和XRCC6 RS5751129的变异基因型与童年的几率增加都显着相关。基于敏感性基因型的进一步分析显示，除XRCC6 RS5751129外，儿童期在儿童时期的mRNA转录表达水平没有显着差异。此外，在不同XRCC4，XRCC5和XRCC6基因型的载体中，NHEJ的总体维修能力相似。但是，值得注意的是，与具有野生型T等位基因的人相比，携带XRCC6 rs5751129的变体C等位基因的个体表现出较低的精确NHEJ修复能力。结论：我们的研究确定了XRCC4 RS3734091，RS28360071，XRCC5 RS828907和XRCC6 RS5751129基因型和儿童期之间的显着关联。值得注意的是，在携带XRCC6 rs5751129的C等位基因的患者中观察到较低的转录表达和降低的精确NHEJ修复能力。需要进行进一步的调查，以深入了解儿童时期的所有发展。
CRISPR–Cas9 介导的拟南芥可遗传染色体易位的诱导
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) - CRISPR 相关蛋白 (Cas) 技术已应用于植物育种，主要用于改良单个或多个性状的基因 1 – 4 。本文我们表明，这项技术还可用于重组植物染色体。利用来自金黄色葡萄球菌 5 的 Cas9 核酸酶，我们能够在拟南芥中诱导异源染色体之间 Mbp 范围内的相互易位。值得注意的是，在没有经典的非同源末端连接途径的情况下，易位频率大约高出五倍。利用 Cas9 核酸酶的卵细胞特异性表达和连续的批量筛选，我们能够分离可遗传事件并建立易位纯合的品系，单个品系的频率高达 2.5%。通过分子和细胞学分析，我们证实了在拟南芥 1 号和 2 号染色体之间以及 1 号和 5 号染色体之间获得的染色体臂交换是保守的和相互的。诱导染色体易位可以有针对性地模拟基因组进化或染色体修改，固定或打破不同染色体上性状之间的遗传连锁。植物基因组的受控重组有可能改变植物育种。鉴于养活快速增长的人口的挑战以及气候变化对农业的影响，对新作物品种的需求日益增加。随着传统育种已达到极限，使用基因组编辑工具对作物进行理想性状改造正成为主要关注点 6 。应用 CRISPR-Cas 系统定向诱导位点特异性双链断裂 (DSB) 使得基因编辑既可用于植物基础研究，也可用于农业性状的产生和改良 7 。在包括植物在内的多细胞真核生物中，DSB 的修复主要由两种途径介导，非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 8 。通过易错的 NHEJ 进行的修复通常与断裂位点处的序列信息丢失有关，而同源重组主要导致无错修复 9 。在植物中，NHEJ 是体细胞组织中普遍的修复途径。NHEJ 可进一步细分为经典 NHEJ (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径 10 。在 cNHEJ 的情况下，断端直接重新连接，有时会导致断裂位点处的小插入或缺失 (indel)。aNHEJ 利用靠近断裂位点的微同源性并依赖于聚合酶 theta，导致与插入部分相关的微同源性之间的序列信息缺失 11,12 。一次诱导多个 DSB 可以通过 NHEJ 将不相关的断裂末端连接起来，从而导致基因组中复杂的重排。
通过DNA-PKCS的药理延迟增强CRISPR删除
CRISPR-CAS9缺失（CRISPR-DEL）是消除哺乳动物细胞中DNA的领先方法，并为各种基因组编辑的应用提供了基础。靶DNA在非同源最终连接（NHEJ）期间由一对双链断裂（DSB）定义。但是，CRISPR-DEL的低效率导致了费力的实验和错误的负面结果。通过使用内源性报告基因系统，我们表明DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKC）的抑制作用（NHEJ的早期一步）会大大增加DNA缺失。这是在各种细胞系，基因递送方法，商业抑制剂和引导RNA中观察到的，包括那些表现出可忽略的活性的RNA。我们进一步表明，DNA-PKCS抑制作用可用于提高合并功能屏幕的灵敏度，并检测否则会忽略的真实阳性命中。因此，延迟NHEJ相对于DSB形成的动力学是增强CRISPR损坏的一种简单有效的手段。