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World File Search SystemNanobret
fady R. Mohareb
Nanobret™靶标参与（TE）细胞内激酶测定法在完整细胞内的精选激酶蛋白靶标处定量化合物结合。该目标参与分析基于Nanobret™系统，这是一种旨在测量活细胞中分子接近的生物发光能量转移（BRET）技术。具体而言，该测定法使用测试化合物和可渗透荧光纳米骨架™示踪剂之间的竞争位移，该曲线可与细胞中表达的Nanoluc®荧光素酶 - 激酶融合蛋白可逆地结合。纳米细胞内激酶测定和特定的激酶-Nanoluc®荧光素酶融合载体一起用于测量活细胞中的激酶化合物亲和力，占用率和停留时间。
基于马来酰亚胺支架
表6。 通过纳米伯雷测定法对化合物31和41（Discoverx kinomescan）和细胞验证的Kinome选择性分析。 除了CLK2和CLK4外，还列出了鉴定为与激素中化合物结合的前10个激酶。完整的数据集在补充材料中可用。 nd =未确定。 示例纳米伯特结合曲线可以在补充图2中看到。 请注意，与上面的化合物2和4相比，使用了不同的示踪剂化合物进行STK10和SLK纳米杆元测量。表6。通过纳米伯雷测定法对化合物31和41（Discoverx kinomescan）和细胞验证的Kinome选择性分析。除了CLK2和CLK4外，还列出了鉴定为与激素中化合物结合的前10个激酶。完整的数据集在补充材料中可用。nd =未确定。示例纳米伯特结合曲线可以在补充图2中看到。请注意，与上面的化合物2和4相比，使用了不同的示踪剂化合物进行STK10和SLK纳米杆元测量。
MDC连接：药物发现指南
纳米杆技术使用生物发光共振能量转移（BRET）研究活细胞中蛋白质蛋白质的相互作用。研究了成人骨形成的调节剂Schnurri-3的相互作用，与ERK-2使用了2个不同的载体。一个载体包含Schnurri-3和Nanoluc®，一种具有高效率生成光子的发光酶，第二个载体包含ERK-2 PlusHalotag®，荧光配体。当两种蛋白质接近近距离时，观察到荧光。确定了Schnurri-3-ERK相互作用抑制剂的纳米伯特分析以及纳米信号与荧光信号的比率。使用MEK在竞争相互作用的单元格中验证了这一点，如果过表达，则会降低荧光信号。
免疫治疗
a）（左）PRMT5纳米底测定的示意图以及MTA或SAM对示踪剂结合的影响，改编自参考文献2。（右）HCT116等生成对中的PRMT5纳米杆。细胞用指定剂量的IDE397预处理23小时，并测量对示踪剂结合的影响（左）。预先处理IDE397（23小时），然后添加MRTX1719持续2小时（右）。b）HCT116 wt（顶行）或mtap-/ - （底行）中IDE397的全剂量矩阵和PRMT5抑制剂;热图中显示的明显目标占用率。由10µM GSK3326595（探针母体分子） + 100nm的IDE397预处理前的MBRET比定义了100％的明显占用（最大探针位移）。0％的明显占用率仅代表DMSO。因此，100％明显的目标占用率代表PRMT5抑制剂与PRMT5的最大结合。
protac细胞内积累的定量测量
近年来，靶向嵌合体（Protac）技术的蛋白水解已成为通过利用细胞自己的破坏机制来清除与疾病相关蛋白质的最有希望的方法之一。要获得感兴趣的蛋白质（POI）的成功降解，杂功能的Protac分子必须首先穿透到细胞中，然后靶向靶标和POI-PROTAC-E3连接酶复合物的靶标和形成。基于这种理解，对细胞渗透性和细胞靶标的评估评估对于评估Protac候选物的疗效至关重要。Protac分子可以分类为非共价和共价，并且可以将共价Protac进一步分为不可逆的和可逆的共价。在这里，我们提出了一个高通量测定法，以使用激酶结合测定和纳米伯特目标参与平台定量测量其细胞内积累来确定不同类型的BTK Protac。
KME-0584，一种高度有效的IRAK1/irak4/panflt3抑制剂，是低甲基化剂和耐Venetoclax抗性AML/MDS
NF-κB报告基因测定。根据THP-1-蓝色NF-κB细胞和Quanti-Blue试剂制造方案（Invivogen）进行。菌落成型单元（CFU）。主要的AML患者样品是从发现生命科学（DLS）获得的，并在甲基纤维素测定中进行了测试。生化和基于细胞的激酶抑制测定。激酶抑制数据和基于细胞的激酶测定是使用RBCHotSpot®激酶和Nanobret®分析获得的，分别在Rectionbio（Malvern，PA）上进行。结合动力学测定。使用KineticFinder®TR-FRET分析在酶logic上进行。异种移植。生存分析在用Molm14 Flt3-ITD（D835Y）细胞的NSG-SGM3小鼠中进行。药代动力学筛查和离子通道面板。测试是在Pharmaron进行的。rnaseq。THP-1细胞在液体培养中进行24小时。 提取总RNA，并以每个样品的30m读取进行RNASEQ。 统计分析。 使用GraphPad Prism绘制了所有数据，并使用t检验确定统计显着性。THP-1细胞在液体培养中进行24小时。总RNA，并以每个样品的30m读取进行RNASEQ。统计分析。使用GraphPad Prism绘制了所有数据，并使用t检验确定统计显着性。
发现PTK7/β-...
摘要：全世界癌症，结直肠癌（CRC）导致的第二个死亡原因是一个主要的公共卫生问题。因此，发现新的治疗靶标是必不可少的。假酶PTK7介入Wnt/β-catenin途径信号传导的调节，部分地通过激酶域依赖性与β-catenin蛋白的相互作用。ptk7在CRC中过表达；与转移性发育和非转移性患者存活降低相关的事件。此外，在CRC中鉴定出了许多改变，从而通过β-catenin积累诱导Wnt/β-catenin途径的组成型激活。因此，我们认为靶向PTK7/β-catenin相互作用可能与未来的药物开发有关。在这项研究中，我们开发了一种纳米伯特TM筛选测定法，概括了PTK7和β-catenin之间的相互作用，以鉴定能够破坏这种蛋白质蛋白质相互作用的化合物。高吞吐量筛选使我们能够鉴定针对Wnt途径信号传导的小分子抑制剂，并在含有PTK7下游的CRC细胞中诱导抗β-catenin或APC突变的CRC细胞中引起抗增殖作用。因此，对PTK7/β-catenin相互作用的抑制作用可以代表一种新的治疗策略，以抑制Wnt信号传导途径的细胞生长。此外，尽管其酪氨酸激酶结构域缺乏酶促活性，但针对PTK7激酶结构域依赖性功能似乎对进一步的治疗性发育感到有意义。
使用 DNA 编码化学技术鉴定有效的泛 Ephrin 受体激酶抑制剂
EPH 受体 (EPHs) 是酪氨酸激酶的最大家族，在与 Ephrin 细胞表面相关配体结合后磷酸化下游底物。在来自子宫内膜异位症患者的大量子宫内膜异位病变中，我们发现子宫内膜异位病变中的 EPHA2 和 EPHA4 表达相对于正常的正常子宫内膜有所增加。由于通过 EPHs 的信号传导与细胞迁移和侵袭增加有关，我们假设化学抑制 EPHA2/4 可能具有治疗价值。我们筛选了 DNA 编码化学库 (DECL) 以快速识别 EPHA2/4 激酶抑制剂。命中化合物 CDD - 2693 对 EPHA2 (K i : 4.0 nM) 和 EPHA4 (K i : 0.81 nM) 表现出皮摩尔/纳摩尔激酶活性。激酶组分析显示，CDD-2693 与大多数 EPH 家族和 SRC 家族激酶结合。使用 NanoBRET 靶标参与分析，CDD-2693 对 EPHA2 (IC 50 : 461 nM) 和 EPHA4 (IC 50 : 40 nM) 具有纳摩尔活性，但对 SRC、YES 和 FGR 具有微摩尔抑制剂活性。化学优化产生了 CDD-3167，对 EPHA2 (K i : 0.13 nM) 和 EPHA4 (K i : 0.38 nM) 具有皮摩尔生化活性，对 EPHA2 (IC 50 : 8.0 nM) 和 EPHA4 (IC 50 : 2.3 nM) 具有出色的细胞效力。此外，CDD-3167 保持了卓越的脱靶细胞选择性。在 12Z 子宫内膜异位上皮细胞中，CDD - 2693 和 CDD - 3167 显著降低了 EFNA5（配体）诱导的 EPHA2/4 磷酸化，降低了 12Z 细胞活力，并降低了 IL - 1 β 介导的前列腺素合酶 2 ( PTGS2 ) 表达。CDD - 2693 和 CDD - 3167 降低了子宫内膜异位症患者原发性子宫内膜上皮类器官的扩增，并降低了尤文氏肉瘤的活力。因此，使用 DECL，我们确定了有效的泛 EPH 抑制剂，这些抑制剂在子宫内膜异位症和癌症的细胞模型中表现出特异性和活性。