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通过腺病毒载体转移优化的 CRISPR-Cas9 成分整合基因传递和基因编辑技术
摘要 增强 RNA 引导的 CRISPR-Cas9 核酸酶 (RGN) 的细胞内递送和性能仍然有需求。在这里，我们表明常用的化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白的核转位并不理想。因此，我们通过为高特异性 eSpCas9(1.1) 核酸酶 (eCas9.2NLS) 赋予额外的核定位信号 (NLS) 来生成 eCas9.4NLS。我们证明与原型或优化的引导 RNA 偶联的 eCas9.4NLS 可实现有效的靶向 DNA 切割，并探究具有不同 NLS 组成的 SpCas9 蛋白在异染色质和真染色质中嵌入的靶序列上的性能。此外，在腺病毒载体 (AdV) 介导的 SpCas9 表达单元转移后，无偏定量免疫荧光显微镜显示 eCas9.4NLS 核富集水平比高特异性 eCas9.2NLS 的核富集水平高 2.3 倍。这种改进的核易位反过来在非同源末端连接修复靶向双链 DNA 断裂后产生了强大的基因编辑。具体而言，AdV 将 eCas9.4NLS 递送到肌肉祖细胞中，导致有缺陷的 DMD 等位基因（导致杜氏肌营养不良症 (DMD)）的编辑频率明显高于编码亲本 eCas9.2NLS 蛋白的 AdV 所实现的编辑频率。总之，这项工作为整合病毒载体和优化的基因编辑技术以增强 RGN 递送和性能提供了强有力的理论基础。
斑马鱼胚胎显微注射 - NET
此方案是使用已停产的 Cas9 蛋白版本 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease 3NLS) 开发的。目前可用的产品 (Alt-R Cas9 Nuclease V3) 具有改进的 NLS，应以相同的体积和浓度直接替换到此方案中。IDT 建议使用 Alt-R™ Sp Cas9 Nuclease V3 与 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA 结合使用，以生成核糖核蛋白编辑复合物，从而在大多数目标位点上实现高编辑效率。查看 Alt-R CRISPR-Cas9 用户指南，了解如何将核糖核蛋白转染哺乳动物细胞系（可在 www.idtdna.com/CRISPR 上找到）。
夏季阅读计划
读书俱乐部发射板（青少年 /成人）：7月1日，星期一，美国东部时间下午1:00 - 您是否想开设自己的读书俱乐部，但不知道从哪里开始？这是您的机会！加入我们，在7月25日星期四举办的NLS主持作者活动之前，在Angeline Boulley（DB 102762 / BR 24040）对Firekeeper的女儿介绍。< / div>。< / div>本次会议将介绍本书和作者的背景，探索主题并提供讨论问题。这将使您准备与家人和朋友一起建立自己的迷你书俱乐部，以便在作者活动之前阅读这本书。然后作为一个小组收看，并喜欢这位密歇根州作家的聆听！皇家岛国家公园游侠Talk（所有年龄段）：7月10日，星期三，美国东部时间下午1:00 - 加入有关密歇根州自己的国家公园的激动人心的现场演讲！ 这项Zoom活动将由公园游骑兵领导，公园护林员将讨论位置，生态，野生动植物和其他公园的特定细节。 此计划仅提供给密歇根州的顾客。 Ear and Beyond（成人）的观鸟：7月15日，星期一，美国东部时间下午1:00 - 加入我们，由Um-Dearborn校友Donna Posont协调的Zoom演示文稿，他本人是盲人。 Donna毕业于大学的环境研究学位，是美国第二位被美国国家解释协会（NAI）认可为认证解释性指南的盲人。 唐娜（Div>）唐娜（Donna）在伯恩（Ear and Beyond）的观鸟中的努力受到了全国关注。 此计划仅提供给密歇根州的顾客。 为您的家人可以跳舞，唱歌和娱乐而进行有趣，互动的变焦。 （NLS LED事件）。皇家岛国家公园游侠Talk（所有年龄段）：7月10日，星期三，美国东部时间下午1:00 - 加入有关密歇根州自己的国家公园的激动人心的现场演讲！这项Zoom活动将由公园游骑兵领导，公园护林员将讨论位置，生态，野生动植物和其他公园的特定细节。此计划仅提供给密歇根州的顾客。Ear and Beyond（成人）的观鸟：7月15日，星期一，美国东部时间下午1:00 - 加入我们，由Um-Dearborn校友Donna Posont协调的Zoom演示文稿，他本人是盲人。Donna毕业于大学的环境研究学位，是美国第二位被美国国家解释协会（NAI）认可为认证解释性指南的盲人。唐娜（Div>）唐娜（Donna）在伯恩（Ear and Beyond）的观鸟中的努力受到了全国关注。此计划仅提供给密歇根州的顾客。为您的家人可以跳舞，唱歌和娱乐而进行有趣，互动的变焦。（NLS LED事件）。Turtle Dance Music（儿童 /家庭）：7月18日，星期四，美国东部时间下午4:00 - 乌龟舞蹈音乐人Matt Mazur回来了！马特将带领我们唱歌，跳舞，对待年轻的读者，读过Oge Mora（BR 23018，DB 98170）的星期六。这是与全国顾客一起摆脱这些摆动的最佳时机！作者与安吉琳·布利（Angeline Boulley）（青少年 /成人）交谈：7月25日，星期四，美国东部时间7:00。纽约时报畅销书作家安吉琳·布利（Angeline Boulley）将与屡获殊荣的作家安德里亚·罗杰斯（Andrea L. Rogers）交谈，讨论她的书《消防员的女儿》（BR 24040，db 102762）和《勇士女孩》（BR 25116，DB 114761）。演讲结束后，该活动的录制将进行两个星期。NLS LED事件。其他机会：•活动委员会 - 从我们的“活动委员会”中完成5项活动，将进入大奖。•虚拟逃生室 - 此可访问的逃生室选项使用Google表格为您和您的朋友提供有趣的体验。•问题？电子邮件：wambaughs@michigan.gov，电话：1-800-992-9012
TRUECUT™CAS9蛋白
Invitrogen™TRUECUT™Cas9蛋白用于使用CRISPR技术的基因组编辑应用。cas9蛋白与CRISPR-CAS9系统的引导RNA（GRNA）成分形成非常稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物。纳入核定位信号（NLS）的掺入有助于其向细胞核的传递，从而增加了基因组DNA裂解的速率。与质粒系统相比，它可以迅速清除，从而最大程度地减少了脱靶裂解的机会（Liang等，2015）。与基于质粒的CRISPR系统相比，CAS9核酸酶已在多种悬浮液和粘附细胞系中进行了测试，并且显示出优异的基因组裂解效率和细胞的生存能力。
2011 年 10 月 - 科技部
其他显著成就包括：PSLV-C9 一次发射发射了 10 颗卫星（包括 CARTOSAT-2A 和 IMS-1）；PSLV-C12 搭载微波雷达卫星 (RISAT-2) 和微型卫星 ANUSAT；PSLV-C14 搭载 OCEANSAT-2 和六颗纳米卫星；PSLV-C15 搭载 CARTOSAT-2B、ALSAT-2A、NLS 6.1 & 6.2 和 STUDSAT；PSLV-C16 搭载 RESOURCESAT-2、YOUTHSAT 和 X-SAT。随着 INSAT-4CR（搭载 GSLV-F04）、GSAT- 12（搭载 PSLV-C17）和 GSAT-8（采购发射）的发射，INSAT/GSAT 系统得到进一步增强。两颗面向国际客户的卫星（AGILE 和 TECSAR）由 PSLV-C8 和 PSLV-C10 以商业方式发射。此外，还为欧洲客户建造了两颗最先进的通信卫星（W2M 和 HYLAS）。此外，四项正在进行的主要任务正准备发射
Mukherjee_ASGCT USH2A 海报_最终版
图 1：EDIT-102 的作用机制。*USH2A 基因中的 Ex13 代表导致 IRD 的任何外显子 13 突变，包括 c.2299delG。EDIT-102 编码人类 U6 启动子、向导 RNA（gRNA；RSQ9145 和 RSQ9265）、hGRK1 启动子、SV40（猿猴病毒 40）SD/SA（剪接供体/剪接受体）序列元素、NLS（核定位序列）、Sa（金黄色葡萄球菌）Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）和 pA（多聚腺苷酸化信号）。EDIT-102 在 USH2A 外显子 13 的两侧进行编辑，导致外显子 13 从基因组和 mRNA 中去除，从而产生缺乏氨基酸 723-936 的功能性 Usherin 蛋白。
转录因子凝结物的工程材料特性控制哺乳动物细胞和小鼠中的基因表达
和进一步经历了同性恋，导致多价相互作用和LLP的诱导。VP16被募集到CMV最小启动子提供的转录起始位点，并诱导报告基因表达。（b）调整转化因子冷凝物的材料特性。要修改凝结物材料特性，采用了两种策略：首先，通过将CRY2换成Cry2 Olig，从而增加了相互作用的价值，而Cry2 Olig构成了高阶寡聚物；其次，通过共转染编码融合到麦克里（可视化）和fus n和nLS的cry2 olig的结构来提高价值和浓度。与CRY2-EYFP-FUS N -VP16或CREY2 OLIG -EYFP-FUS N -VP16构建体（黄色和绿色数据点）共转染了编码CIBN-TER和基于TETO 4的SEAP报告基因。可选地，添加了编码Cry2 Olig -MCH -MCH -FUS n -nls的构造（以2：1的质粒量比为2：1相对于含VP16的构建体，红色和黑色数据点）。在进行FRAP分析之前，将细胞在黑暗中培养32小时。蓝光照明10分钟后（2.5 µmol m -²S-1）开始。 图像在液滴漂白之前直接显示出反应性核。比例尺= 5 µm。 图显示了根据n≥7凝结物回收曲线的非线性拟合计算出的移动部分的平均值和单个值（请参见右图）。 使用学生的t.test（*=p≤0.05; **** =p≤0.0001）进行成对比较。。图像在液滴漂白之前直接显示出反应性核。比例尺= 5 µm。图显示了根据n≥7凝结物回收曲线的非线性拟合计算出的移动部分的平均值和单个值（请参见右图）。使用学生的t.test（*=p≤0.05; **** =p≤0.0001）进行成对比较。
4-羟基-2-壬烯醛通过抑制 Xpo1 并促进细胞核中的蛋白水解途径，导致 p62 在细胞核中积累
p62 是一种参与选择性自噬的衔接蛋白，正常情况下主要存在于细胞质中。由于 p62 具有核定位信号 (NLS) 和核输出信号，因此有人认为 p62 在细胞核和细胞质之间穿梭。我们研究了内源性脂质过氧化产物 4-羟基壬烯醛 (4-HNE) 对小鼠胚胎成纤维细胞内 p62 分布的影响。我们发现 4-HNE 处理会导致 p62 从细胞质易位到细胞核。进一步分析表明，4-HNE 直接与输出蛋白-1 (Xpo1) 结合，后者是各种蛋白质核输出所必需的蛋白质。进一步分析发现 4-HNE 以 p62 依赖的方式增强了核内 EGFP- NLS-CL1 降解。我们的结果表明，4-HNE 通过抑制 Xpo1 改变了 p62 定位到细胞核，并可能影响核内蛋白质的质量控制。
基因编辑
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。
翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有 表达带双端核定位序列 （ NLS ）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框，通过 TransIT-X2 (Mirus) 转染 试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端 核定位序列，使用 transIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。 Cas9 RNPs 使用脂质 体 RNAiMAX ( Life Technologies ) 进行反向转染， RNP 的终浓度为 10 nmol 。 Cas9 蛋白上不含 核定位序列。 EnGen Cas9 含有双端核定位序列。编辑效率通过 T7E1 实验进行分析，结果 以修饰百分比进行统计。