当前的CAR转基因输送和表达策略受到以下限制:➢通过慢病毒或转座子通过慢性病毒或转座的半随机整合危险,即在核酸酶 + to ndrate +限制与DSB诱导相关的HDR限制的核酸酶 +模板的核酸酶积分的靶向整合(例如/chromothips)
摘要:设计师核酸酶的发现使基因组的编辑比以前更加有效。设计师核酸酶已被广泛用于机械研究,动物模型产生和基因治疗的发展。但是,潜在的靶标和宿主免疫反应是体内用途,尤其是临床应用仍需要解决问题。设计师核酸酶的短期表达对于降低两种风险是必要的。当前,正在开发各种递送方法,用于用于瞬时核酸酶的瞬时表达,包括锌指核酸酶(ZNF),转录激活剂样的效应核酸酶(TALEN)和定期间隔的短裂缝短底膜重复序列 / CRISPR与CRISPR相关(CRISPR / CAS)。最近,病毒样颗粒被用于基因编辑。在这篇综述中,我们将通过常用的基因组编辑核酸酶进行讨论,讨论基因编辑递送工具,并使用病毒样颗粒来回顾最新文献,以传递基因编辑效果。
引言基因组编辑工具为生物科学提供了巨大优势[1,2]。现已开发出各种技术,包括锌指内切酶 (ZFN)、转录激活物样效应核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关核酸酶 (CRISPR/Cas) 系统,以提供高效的基因编辑,从而治疗癌症以及传染性和遗传性疾病[3,4]。此外,基因组编辑工具为癌症的基础研究和诊断提供了新的机会,包括设计简单、操作快速、成本低和强大的可扩展性等广泛优势,CRISPR/Cas 是一种快速发展的编辑方法,适用于几乎所有基因组目标[5-7]。从历史上看,“CRISPR”一词由 Mojica 和 Ruud Jansen (2001) 提出[8];Ishino 等人首次在大肠杆菌中发现此类回文重复序列。 (1987)[ 9 ]。这些序列的功能直到 2005 年才明了。Mojica 等人(2005 年)首次指出 CRISPR 在细菌免疫系统中发挥重要作用 [ 10 ]。分子报告
摘要:从理论上讲,可以区分等于或超过16 bp的DNA序列的DNA序列特异性识别蛋白可能是哺乳动物基因组独有的。长期序列的核酸酶,例如天然存在的归巢核酸酶和人工设计的ZFN,TALEN和CAS9-SGRNA。与其他对应物(通过蛋白质部分识别DNA靶位点的其他对应物相比,CAS9使用单个指南RNA(SGRNA)作为DNA靶标识别的模板。由于设计和合成目标位点的SGRNA的简单性,CAS9-SGRNA已成为基因组编辑的最新工具。此外,Cas9-SgrNA的RNA引导的DNA识别活性与HNH结构域和RUVC结构域的非平均链中的核酸酶活性无关,而HNH核酸酶无核酶无效无效无效活性无效(H 840 A)和RUVC核酸酶核酸酶活性无效null null突变(识别10 A)。与SGRNA,CAS9,Cas9(D 10 A),Cas9(H 840 A)和Cas9(D 10 A,H 840 A)一起用于实现双重链断裂,互补的链断管破裂,非满足链破裂,并且分别在TARPEC上进行破裂。基于这种独特的特征,可以在靶位点内或周围引入许多工程酶活性,例如DNA甲基化,组蛋白甲基化,组蛋白乙酰化,胞苷脱氨酸,腺嘌呤脱氨基和启动引导突变。为了防止Cas9衍生物的持久表达靶向,开发了许多瞬态表达方法,包括直接递送Cas9-SgrNA核糖蛋白。生物安全问题在体内应用中是必不可少的;已经设计了包装到病毒样颗粒或细胞外囊泡中的CAS9-SGRNA,已经报道了一些体内治疗试验。
图 1.与其他修饰相比,具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比,具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 (A)供体寡核苷酸修改的示意图。 (B)每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统(Lonza)将四个靶向基因位点的 RNP 复合物(2 µM)与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3,以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸:未经任何修饰的寡核苷酸(未修饰的)、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸(PS 修饰的)和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸(Alt-R HDR 修饰的)。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。
要查看TALEN目标,请单击表的“ Talen”选项卡,并将显示每个Talen对的类似信息。TAL效应子核酸酶(TALEN)对。设计结果表中的绿色选中标记将指示推荐的技术。在Thermofisher.com/tal上了解有关Talen Technology的更多信息。
要查看 TALEN 靶标,请单击表格中的 TALEN 选项卡,每个 TALEN 对都会显示类似的信息。当敲入位点 10 bp 范围内没有 PAM 位点,或者 gRNA 的效率和特异性不理想时,建议使用 TAL 效应核酸酶 (TALEN) 对。设计结果表中的绿色复选标记将指示推荐的技术。有关 TALEN 技术的更多信息,请访问 thermofisher.com/tal 。
要查看TALEN目标,请单击表的“ Talen”选项卡,并将显示每个Talen对的类似信息。TAL效应子核酸酶(TALEN)对。设计结果表中的绿色选中标记将指示推荐的技术。在Thermofisher.com/tal上了解有关Talen Technology的更多信息。
要查看TALEN目标,请单击表的“ Talen”选项卡,并将显示每个Talen对的类似信息。TAL效应子核酸酶(TALEN)对。设计结果表中的绿色选中标记将指示推荐的技术。在Thermofisher.com/tal上了解有关Talen Technology的更多信息。