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使用牛津纳米孔技术（ONT）
。cc-by 4.0国际许可（未经Peer Review尚未获得认证）是作者/资助者，他已授予Biorxiv的许可证，以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人，该版本发布于2025年1月12日。 https://doi.org/10.1101/2025.01.10.632410 doi：Biorxiv Preprint
mRNA 靶向寡核苷酸疗法的临床前安全性评估
摘要：寡核苷酸疗法 (ONT) 的开发近年来取得了进展。各种 ONT（例如反义寡核苷酸、小干扰 RNA 和 microRNA）通过与 mRNA 序列杂交发挥药理作用，并且由于序列同源性，它们还可以与非预期的 mRNA 序列结合。因此，应通过判断临床前研究中杂交依赖的靶向和脱靶毒性来评估 ONT 的安全性。由于脱靶毒性是 ONT 所独有的，因此很难根据目前为小分子和生物技术衍生药物制定的指导方针来评估其安全性；因此，一些研究小组，例如药物信息协会 (DIA) 的寡核苷酸安全工作组，已经提出了 ONT 临床前安全性评估的概念。虽然目前没有针对 ONT 的国际人用药品技术要求协调会 (ICH) 指南，但 ICH S6 指南指出“本指南中概述的原则也可能适用于寡核苷酸药物。”最近，日本工作组制定了 ONT 的临床前安全性指南，以解决与 ICH S6 相关的问题。本文基于本指南讨论了 mRNA 靶向 ONT 的临床前安全性评估。关键词：寡核苷酸疗法、临床前安全性评估、个案方法、杂交依赖性毒性
寡核苷酸疗法的非临床安全性评估
本指南包括针对合成或天然衍生的单链或双链 ONT 的建议，这些 ONT 具有天然或经过修饰的主链或核苷结构，可增加或减少蛋白质的表达和/或功能。所包括的寡核苷酸的例子有反义寡核苷酸、小干扰 RNA、microRNA、转移 RNA、诱饵和适体。免疫刺激性寡核苷酸（例如，通过 Toll 样受体起作用的 CpG 基序）和 CBER 监管产品（例如，DNA/RNA 疫苗、病毒递送的 ONT、信使 RNA 和用于基因编辑的 RNA）不包括在内。如果寡核苷酸本身属于本指南的范围，则包括与其他类型分子（例如，糖类、脂质、肽、抗体）结合的寡核苷酸。
dive novo纳米孔基因组测序临床Diutina catenulata型型cbs565
受污染的奶酪，但这种物种越来越多地据报道，该物种越来越多地显示出高丙核麦克风的奶酪，这是人类侵入性感染的原因[4-6]。在这里，我们提供了从头基因组组装和临床D. catenulata型CBS565的注释。D. catenulata型CBS565在1926年是从一个痴呆症患者的粪便中分离出来的，当时居住在波多黎各[1]。基因组DNA提取。使用连接测序试剂盒（SQK-LSK109; ONT，UK，UK）和本机条形码套件（EXP-NBD114; ONT）进行连接测序试剂盒（SQK-LSK109； ONT）进行纳米孔测序文库制备。根据制造商的协议，将两个库运行到奴才流中心（Flo-Min106; ont）上。使用Guppy v5.0.16对原始的纳米孔读数进行了基础？B9FCD7B5B（ONT）使用设置 - 浮雕flo-min106-Kit SQK-LSK109-Barcode_kits exp-nbd114-device cuda：0，由消除电源和条形码放在同一软件中。使用参数-nano- raw \ fastq [ - uot-dir \ directory \ div> flye v2.9（https：//github.com/ fenderglass/flye; [8]）进行 de Novo基因组组装。使用GenomeQC评估了组装的基因组质量[9]。总基因组大小为14,464,696 bp，n50为2,438,920 bp，在9个重叠群上分配（范围为3,918,888-888-370,337 bp;
使用可调参数的纳米孔测序信号数据
是一种在基因组学领域中广泛使用的技术。但是，目前缺乏从纳米孔测序设备创建模拟数据的有效工具，这些工具以时间序列的当前信号数据的形式测量DNA或RNA分子。在这里，我们介绍了Squigulator，这是一个快速而简单的工具，用于模拟逼真的纳米孔信号数据。s弹器采用参考基因组，转录组或读取序列，并生成相应的原始纳米孔信号数据。这与牛津纳米孔技术（ONT）和其他第三方工具的基本软件兼容，从而为纳米孔分析工作流的每个阶段提供了有用的基板，用于开发，测试，调试，验证和优化。用户可以使用模拟特定ONT协议或无噪声“理想”数据的预设参数生成数据，或者他们可以确定性地修改一系列实验变量和/或噪声参数以满足其需求。我们提供了一个简短的用途示例，创建了模拟数据，以模拟不同参数影响ONT基本和下游变体检测准确性的程度。此分析揭示了对ONT数据和基本算法的性质的新见解。我们为纳米孔社区提供了旋转器作为开源工具。
改进的甲型流感全基因组测序方案
甲型流感病毒突变率高且具有人畜共患潜力，对公共卫生构成重大挑战。全基因组测序 (WGS) 对于监测和鉴定这些病毒至关重要。通常使用牛津纳米孔技术 (ONT) 和 Illumina 新一代测序平台，其中 ONT 的优势在于其长读取能力、可移植性以及在测序过程中实时访问原始数据的独特能力，使其适合快速应对疫情。本研究通过改进 RT-PCR 试剂盒、引物和纯化方法，并评估高通量处理的自动化，优化了 ONT 连接测序甲型流感全基因组方案。与原始 ONT 方案相比，替代 RT-PCR 试剂盒与替代引物相结合，显著提高了读取深度覆盖率，并减少了短而非靶向的读取。这种改进在聚合酶片段的最小读取深度覆盖率方面尤为明显，而聚合酶片段通常面临实现均匀覆盖率的挑战，在 5' 和 3' 末端显示较高的覆盖率，而在中心区域显示较低的覆盖率。这种针对甲型流感 WGS 的优化方案不仅提高了测序质量和效率，而且适用于所有 NGS 平台，因此对于研究流感适应性和改进监测非常有价值。此外，该方案可以进一步完善和调整以用于其他病原体的测序，从而扩大其在各种病原体监测和应对工作中的实用性。
使用长阅读测序
图1。SAM-SEQ同时探测植物组织上的染色质访问性和DNA甲基化。a。SAM-SEQ方案的工作流程和GDNA上M6A-MTase序列偏好的评估（EcoGII-WEALED GDNA）。 b。 链特异性的M6a水平的ECOGII处理的基因组DNA水平在标准化之前和之后，M6A-MTase偏好比五个A. thaliana染色体。 centromeres被描述为灰色盒子。 拟南芥12-mer序列的 c umap投影，由m6a/a含量的ecogii处理的gDNA，含量和含量。 MCG，MCHG和MCHH水平的GDNA和SAM-SEQ的ONT测序之间的密度图和相关分析。 e。 链特异性的SAM-SEQ M6A水平M6A-MTases偏好归一化和之后。 f。 拟南芥基因的元数据显示ATAC-SEQ可及性（Lu等人 2017）（右Y轴）和SAM-SEQ染色质可及性（M6A/A），使用独立的实验使用不同的M6A-MTases（ECOGII或HIA5）以及不同的ONT化学（R9.4.1或R10）（左Y轴）（左Y轴）。SAM-SEQ方案的工作流程和GDNA上M6A-MTase序列偏好的评估（EcoGII-WEALED GDNA）。b。链特异性的M6a水平的ECOGII处理的基因组DNA水平在标准化之前和之后，M6A-MTase偏好比五个A. thaliana染色体。centromeres被描述为灰色盒子。c umap投影，由m6a/a含量的ecogii处理的gDNA，含量和含量。MCG，MCHG和MCHH水平的GDNA和SAM-SEQ的ONT测序之间的密度图和相关分析。e。链特异性的SAM-SEQ M6A水平M6A-MTases偏好归一化和之后。f。拟南芥基因的元数据显示ATAC-SEQ可及性（Lu等人2017）（右Y轴）和SAM-SEQ染色质可及性（M6A/A），使用独立的实验使用不同的M6A-MTases（ECOGII或HIA5）以及不同的ONT化学（R9.4.1或R10）（左Y轴）（左Y轴）。
基准测试揭示了深度学习变体呼叫者对细菌纳米孔序列数据的优越性
摘要14变体调用在细菌基因组学中至关重要，鉴定了疾病的识别15传播簇，系统发育树的构造以及抗菌耐药性养育16。本研究使用牛津纳米孔技术（ONT）和Illumina 18测序对14种不同细菌种类的SNP和INDEL变体进行了全面的基准测试。我们生成金标准参考基因组和项目变化，从密切的19个相关菌株上产生了它们，从而创建了SNP和Indels的生物学现实分布。20我们的结果表明，与传统方法和Illumina相比，基于深度学习的工具的Ont变体调用提供了更高的21 SNP和Indel精度，而Clair3总体上提供了最多的AC-22策展结果。我们研究了错过和错误呼叫的原因，突出了简短读取中固有的限制23，发现Ont的传统限制与均聚物 - 24诱导的Indel错误无关，而高准确的基本模型和深度学习的基于深度学习的25个变体呼叫。此外，我们对读取深度对变体的影响的发现提供了价值26个能力的洞察力，用于对资源有限的测序项目进行测序，这表明10倍深度足够27，以实现匹配或超过Illumina的变体呼叫。28总而言之，我们的研究强调了SNP和Indel 29检测中的深度学习工具的卓越准确性，从而挑战了短阅读测序的至高无上。32系统错误的减少30及在较低的读取深度达到高精度的能力增强了31次通过在临床和公共卫生细菌基因组学中广泛使用的ONT的能力。
nano3p-seq
按照上述步骤，将准备好使用Polytailor。，如果您在运行软件时遇到任何问题，请参考GitHub存储库。安装nano3p-seq数据分析所需的其他ONT软件，可以按照ONT的说明安装这些工具。从以下链接下载并安装minknow：https：//community.nanoporetech.com/downloads下载并从以下链接中安装Dorado：https：//community.nanoporetech.com/downloads for Linux X64系统https://cdn.oxfordnanoportal.com/software/analysis/dorado-0.7.2-linux- x64.tar.gz tar xpfz xpfz dorado-0.7.2-linux-x64.tar.tar.tar.gz echo 〜/.bashrc source〜/.bashrc dorado下载-directory〜/src/dorado/models -model dna_r9.4.1_e8_hac@v3.3 Dorado下载-directory〜/src/src/dorado/dorarado/droplation -model dna_r10 _r10.4.1_e8.1_e8.1_e8.1_400bpsod.0bpso.0bpso. -Directory〜/SRC/Dorado/Models -Model DNA_R9.4.1_E8_SUP@V3.3 Dorado下载-directory〜/src/dorado/Models -model DNA_R10.4.1.4.1_E8.2_400BPS_SUP_SUP_SUP@V5.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0