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利用连续定向进化来改良植物应用的酶
通过在体内大规模地同时进行超突变和选择，微生物宿主中的酶和其他蛋白质的连续定向进化能够超越经典定向进化，并且只需极少的手动输入。如果目标酶的活性可以与宿主细胞的生长相结合，那么只需选择生长就可以提高活性。与所有定向进化一样，连续版本不需要事先了解目标的机制。因此，连续定向进化是修改植物或非植物酶以用于植物代谢研究和工程的有效方法。在这里，我们首先描述用于连续定向进化的酵母（酿酒酵母）OrthoRep 系统的基本特征，并将其与其他系统简要比较。然后，我们将逐步介绍使用 OrthoRep 进化主要代谢酶的三种方式，并以 THI4 噻唑合酶为例并说明获得的突变结果。最后，我们概述了 OrthoRep 的应用，这些应用满足了日益增长的需求：（i）改变植物酶的特性以便返回植物；（ii）改造（“植物化”）原核生物（尤其是外来原核生物）的酶，使其在温和的类植物条件下发挥良好作用。
加州大学欧文分校
通过在体内大规模地同时进行超突变和选择，微生物宿主中的酶和其他蛋白质的连续定向进化能够超越经典定向进化，并且只需极少的手动输入。如果目标酶的活性可以与宿主细胞的生长相结合，那么只需选择生长就可以提高活性。与所有定向进化一样，连续版本不需要事先了解目标的机制。因此，连续定向进化是修改植物或非植物酶以用于植物代谢研究和工程的有效方法。在这里，我们首先描述用于连续定向进化的酵母（酿酒酵母）OrthoRep 系统的基本特征，并将其与其他系统简要比较。然后，我们将逐步介绍使用 OrthoRep 进化主要代谢酶的三种方式，并以 THI4 噻唑合酶为例并说明获得的突变结果。最后，我们概述了 OrthoRep 的应用，这些应用满足了日益增长的需求：（i）改变植物酶的特性以便返回植物；（ii）改造（“植物化”）原核生物（尤其是外来原核生物）的酶，使其在温和的类植物条件下发挥良好作用。
通过体内超成名的氨基酰基-TRNA合成酶的定向演变
抽象的遗传密码扩展（GCE）已通过实现非经典氨基酸（NCAA）的位点掺入到蛋白质中，已成为生物学的关键工具。GCE的中心是正交氨基酰基-TRNA合成酶（AARS）/tRNA对的开发，其中工程的AARS识别所选的NCAA并将其充电到解码空白密码子的TRNA（例如，琥珀终止密码子）。许多正交的AARS/tRNA对涵盖了广泛的NCAA，这是通过定向进化产生的，但是标准策略通过标准策略的新AARS/TRNA对的演变仍然是一个劳动密集型的过程，通常会产生AARS/TRNA对，并产生副最好的NCAA NCAA INCAA Incorpiesies。在这项研究中，我们提出了一种发展AARS的策略，该策略利用Orthorep来推动其在酵母中的连续超女。我们在8个独立的AARS进化运动中展示了我们的战略，从4个不同的AARS/tRNA父母开始，针对7个不同的NCAA。我们观察到了多种新型AARS的快速演变，能够将13个NCAA的整体范围纳入响应于琥珀色密码子的蛋白质中。一些进化的系统达到了琥珀色密码子指定的NCAA依赖性翻译的效率，可与酵母中有义务密码子指定的天然氨基酸翻译相当。此外，我们发现了一个令人惊讶的AAR，它演变为自我调节自己的表达，以更大程度地依赖NCAA进行翻译。这些发现证明了由Orthorep驱动的AARS进化平台支持GCE技术持续增长的潜力。
将连续定向进化用于种植酶的潜力：探索性研究
摘要：植物进化产生的酶可能不是最大程度地提高当今农业环境和植物生物技术应用的最佳产量和质量。通过提高酶的性能，应减轻动力学特性或酶不稳定当前对产量和质量的约束。酶，这需要在体外突变靶基因，并筛选或选择突变的基因产物为所需的特征。连续定向进化是一个更有效，更可扩展的版本，它通过靶基因的易于发达的复制以及宿主细胞的生长速率与靶基因功能的偶联来完成诱变和选择步骤。但是，已发布的连续系统需要自定义的质粒组件，并且不可用的多功能平台。我们讨论了两个适合于酿酒酵母中的酶连续进化的系统，在大肠杆菌中的葡萄糖和evolvr，以及我们的试点效应，以适应每个系统，以用于高通用植物酶工程。为了测试我们的修改系统，我们使用了硫胺素合成酶Thi4，该酶先前鉴定为改进的主要候选者。我们适应的矫正系统显示出对有效植物酶工程的希望。
评论文章适应酶以改善其在植物中的功能：为什么和如何
合成生物学创建了新的代谢过程，并使用工程或天然酶改善了现有生物学。这些酶通常来自与目标植物器官不同的细胞，例如氧化还原电位，效应子水平或蛋白质的机制。因此，即使在其新植物的情况下（“植入”），非本地酶也可能需要适应其在其新植物环境中正常工作（即使其特定的细胞和动力学在体外都足够。因此，有两种不同的方式可以在植物中使用以用于植物的酶：在催化特性中，例如底物和产品植物，K CAT和K M；并且通常与表达酶的细胞环境兼容。连续的定向进化系统可以提供两种类型的改进，并且迄今为止是交付第二种类型的最广泛有效的方法。因此，在本综述中，我们提供了连续演化方法的简短说明，并强调了酵母菌系统，因为它适合植物应用。然后，我们涵盖了始终且日益紧迫的问题，这些酶和酶特性在理论上可以改善或不能改善这些酶，而实际上哪个是最适合作物改善的目标，即实际上可以改进且重要的那些足以保证部署连续的定向进化。，我们以园艺作物为例，因为它们提供的机会并提高了重点。