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栽培禾本科植物基因组编辑的新希望
随着成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 介导的基因组编辑的出现，近年来作物改良取得了重大进展。在这种基因组编辑工具中，CRISPR 相关 Cas 核酸酶通过其首选的原间隔区相邻基序 (PAM) 限制在其 DNA 靶标上。已经开发了许多 CRISPR-Cas 变体，例如 CRISPR-Cas9、-Cas12a 和 -Cas12b，具有不同的 PAM 要求。在这篇小型评论中，我们简要介绍了用于作物改良的基于 CRISPR 的基因组编辑工具的组成部分。此外，我们力图突出介绍 CRISPR 技术的最新发展和突破，重点比较主要变体（CRISPR-Cas9、-Cas12a 和 -Cas12b）与新开发的 CRISPR-SpRY（几乎无 PAM 基因组编辑能力）。此外，我们简要介绍了 CRISPR 技术在改良栽培草类生物和非生物胁迫耐受性以及提高品质和产量方面的应用。
我们愿意在 OMNITM 核酸酶方面开展合作……
成功的基因编辑需要针对每个目标基因和目标器官开发出经过精心优化的组合物。获得各种核酸酶和向导（具有高活性和特异性以及适用的 PAM）以及正确的递送工具是关键。不同的编辑目标需要特定的核酸酶特性，例如核酸酶大小或 PAM 使用，同时表现出极好的特异性。Emendo Biotherapeutics 开发了一种双平台技术，结合了发现流程和尖端蛋白质工程能力，并得到了广泛的计算和机器学习工具的支持。
利用 TadA 的下一代胞嘧啶碱基编辑器
• 脱氨酶的定向进化 • PAM 变体碱基编辑器 • 定向进化 Cas9 以创建用于 BE 的非 NGG PAM 变体 • 密码子、NLS 和接头优化 • 环状置换体和镶嵌碱基编辑器 • DNA 脱靶评估 • RNA 脱靶评估 • 旁观者编辑最小化 • 引导 RNA 工程 • 离体和体内 BE 递送 • 最小化脱靶活性的工程 BE • HSC、肝细胞和 T 细胞的离体碱基编辑 • ABE 的低温电子显微镜结构 • 小鼠体内碱基编辑 • 非人类灵长类动物体内编辑
Cas12a 直系同源物和工程变体的高通量分析，以增强基因组编辑活性
摘要：CRISPR/Cas12a（以前称为 Cpf1）是一种 RNA 引导的 VA 类 CRISPR 系统内切酶，为基因组工程提供了一种有前途的工具。目前已鉴定出 10 多个 Cas12a 直系同源物，并用于人类细胞的基因编辑。然而，新兴 Cas12a 直系同源物之间的功能多样性仍未得到充分探索。本文，我们通过构建包含 40,000 多个引导 RNA 的基因组整合、自切割、配对 crRNA 靶标文库，报告了 16 个 Cas12a 直系同源物在人类细胞中的编辑活性的高通量比较分析。三种 Cas12a 候选物由于其结构紧凑且编辑效率与 AsCas12a 和 LbCas12a 相当而表现出良好的潜力，而 AsCas12a 和 LbCas12a 的特征已得到充分表征。我们通过结构引导的蛋白质工程生成了三种精氨酸替代变体 (3Rv)：BsCas12a-3Rv (K155R/N512R/K518R)、PrCas12a-3Rv (E162R/N519R/K525R) 和 Mb3Cas12a-3Rv (D180R/N581R/K587R)。与野生型 Cas12a 效应子相比，这三种 Cas12a 变体均表现出增强的编辑活性和扩大的靶向范围 (NTTV、NTCV 和 TRTV)。三种 Cas12a 变体之间的碱基偏好分析表明，PrCas12a-3Rv 在具有典型 PAM TTTV 和非典型 PAM TTCV 的靶位点上表现出最高活性，而 Mb3Cas12a-3Rv 表现出与其他变体不同的识别特征，在 PAM TATV 的 -3 位置和 PAM ATCV 的 -4 位置容纳更多的核苷酸 A。因此，扩展的 Cas12a 工具箱和对 Cas12a 活动的更好理解应该有助于它们在基因组工程中的应用。
使用 CRISPR 条形码作为分子钟，以单细胞分辨率捕捉动态过程
图 1. a. 带有 poly-A 读数的动态条形码示意图。b. 实验装置的示意图。c. 基于突变特征的条形码比例，结合两个系统的数据：对具有完整 PAM 基序的原型间隔物进行编辑（活性）；不存在 PAM 基序（非活性）；和未切割的 gRNA（原始）。d. 不同 gRNA 中原始条形码随时间的比例。e. 考虑不同 gRNA 之间的错配、间隙和间隙延伸，条形码随时间的变化。f. 具有 21 bp 间隔物（左）或 26 bp 间隔物（右）的 gRNA 的原始条形码随时间的比例。箱线图按不同时间点的平均间隔物长度着色（Cas9 系统）。g. 原始核苷酸随时间变化的百分比，将间隔物相对于 PAM 序列对齐（Cas9 系统）。h。考虑到按 Cas9 版本分类的所有不同 gRNA，C>T 突变随时间变化的百分比。对于所有箱线图，箱线表示四分位距 (IQR)，每个箱线内的水平线表示中位数。
Quantitative Approaches to Select Dosages for Clinical Trials
• OCE: Rick Pazdur, Marc Theoret • Leads: Atik Rahman, Mirat Shah • RPM: Pam Balcazar • Pharmacology/Toxicology: Haleh Saber, Matthew Thompson • Clinical Pharmacology: Brian Booth, Lanre Okusanya, Stacy Shord • Pharmacometrics: Jiang Liu, Hao Zhu • OCP Policy: Raj Madabushi • Clinical: Brian Heiss, Jennifer Gao, Gwynn Ison, Elizabeth Duke, Shruti Gandhy, Cara Rabik, Pam Seam • Safety: Abhi Nair • Biostatistics: Joyce Cheng, Jonathon Vallejo, Gary Rosner • CBER: Lianne Wu, Xiaofei Wang • Analysts: Alex Akalu, Susan Jenney
Edit-R™ CRISPR 设计工具
图 1. Edit-R™ CRISPR 设计工具如何选择针对人类基因 PPIB 的 20 个核苷酸序列的示例。目标序列可以位于基因组 DNA 的任一链上，只要它处于 5' 到 3' 方向，并且该链的 3' 端有一个 NGG PAM（使用默认的 S. pyogenes Cas9 时）。Cas9 核酸酶将在 NGG PAM 上游三个核苷酸的位置切割 DNA 的两条链。建议选择完全位于编码基因早期组成外显子内的靶位点，但 Edit-R™ CRISPR 设计工具将返回整个编码区域的结果，因此如果需要，可以靶向特定的外显子或蛋白质结构域。