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World File Search SystemPBR322
花椰菜花叶病毒DNA的体内重组
摘要 通过以下实验证明了花椰菜花叶病毒 (CaMV) DNA 的连接和重组：(i) 连接：CaMV 基因组的不同非感染性片段（插入质粒 pBR322 后经酶切获得）在混合接种宿主时恢复感染性。与典型的 CaMV 感染相比，症状出现较晚，并且只有新长出的叶子受到影响。(ii) 重组：成对的非感染性重组全长 CaMV 基因组（在不同的限制性内切酶位点整合到 pBR322 中）在同时接种敏感宿主时恢复感染性。由此产生的感染的症状与典型的 CaMV 感染没有区别。我们表明，子代 DNA 具有与真正的 CaMV DNA 相同的特征（大小、结构、限制性内切酶消化模式），并且载体 pBR322 已被完全消除。部分缺失的克隆 CaMV DNA 串联二聚体在植物测定中同样具有感染性。该系统应该有助于研究突变基因组的表达，从而可以表征 CaMV 基因。
克隆载体
1. 质粒 质粒是自然产生的染色体外 DNA 片段，可以稳定地从一代传到另一代。质粒携带编码抗生素、某些毒素或重金属抗性的基因，或产生 DNA 限制和修饰酶的基因。质粒的拷贝数可以从 1-2 到多个拷贝 (10-200)/细胞不等。质粒用于克隆不超过 10 Kb 的小片段 DNA，该片段位于称为多接头的位点，多接头是一小段 DNA，其中包含许多限制位点，质粒可以用任何限制酶切割这些位点，然后将所需的 DNA 连接到该位点。 pBR322 质粒 pBR322 是 1977 年创建的第一个大肠杆菌中常用的载体。它是一个小质粒（4361 bp），每细胞含有 15-20 个拷贝数，pBR322 还含有复制起点，并带有对氨苄青霉素和四环素的两个抗生素抗性基因。该质粒具有超过 40 种限制性酶的独特限制位点。
DNA放松测定
应该通过使用松弛的质粒进行对照反应来检查超涂层质粒，以表明该化合物不仅可以作为托波斯I的抑制剂，如果有可能。如果使用PBR322的松弛形式，这将显示化合物是否为介导器，但如果它也抑制了topo I（即假阴性是可能的：下面原理图的左手部分中的第5巷）。如果使用了PBR322的超涂层形式，则该化合物是否为介导器，但如果它是Topo I的抑制剂（即假阳性是可能的：下面原理图的右手部分中的泳道6）。但是，如果与化合物相比，小麦细菌topo I的过量是过量的，使得与存在的酶的量相比，任何抑制活性都是无关紧要的，那么任何插入都将显而易见。这假定任何抑制活性是由于与酶的相互作用而不是预防酶活性的插入。
新英格兰生物实验室分析证书
产品名称：pBR322 DNA-BstNI Digest 产品编号：N3031L 浓度：1,000 µg/ml 单位定义：N/A 包装批号：10275473 有效期：12/2026 储存温度：-20°C 储存条件：10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA 规格版本：PS-N3031S/L v1.0
MLH1-PMS1核酸内切酶使用ATP将DNA不连续性作为链歧视信号来促进不匹配维修
图2。MLH1-PMS1的固有ATPase活性失去了PCNA刺激。（a）TLC ATPase分析测量了线性4.3 kb DNA上由MLH1-PMS1水解的ATP量。灰色条代表完整的线性4.3 kb DNA（n = 3），蓝色条代表了线性的4.3 kb DNA，具有4个单链断裂（n = 3）。底物。灰色和蓝色条带有对角线，代表了包含PCNA的实验（n = 3）。（b）灰色条代表在4.3 kb放松，无迹线的圆形DNA上水解的ATP百分比（n = 3），蓝色条代表圆形的4.3 kb DNA，其中包含4个迹线（n = 3）。4.3 kb PBR322。使用nt.bstnbi进行单链断裂。（c）MLH1-PMS1在完整DNA上与包含单链断裂的DNA的ATPase活性模型。
核酸研究
8％聚丙烯酰胺凝胶。cDNA（-0.5 tg）范围为550至1500个碱基对，通过电装饰回收。使用末端脱氧核苷酸转移酶（20）与脱氧残基一起扩展了20 ng等分试样，并用PST I裂解并用Deoxyg残基尾巴（20）将PBR322的100 ng退火100 ng。通过公开的程序（23），使用退火的混合物用于转化大肠杆菌K-12菌株294（22）。制备诱导和未诱导的32P-CDNA探针。5 Zg的12S mRNA与2个寡核酸（DT）12-18（协作研究）或每个合成引物池（FIB 1至FIB 6）的2 Ig合并，在10mm Tris-HCl（pH 8），1 mm EDTA中。将混合物煮沸3分钟，然后在冰上淬火。60 ul of 40 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, 16mM MgCl2, 60 mM o-mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP, dTTP and 5 x 10 7M (Q-32P) dCTP (Amersham, 2,000 - 3,000 Ci/mmole) was added to each template-primer mix at OC.在添加100个AMV逆转录酶后，将反应在42％C下孵育30分钟，并通过超过10 ml Sephadex G-50列的通道纯化。产品用