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人类和动物的粪便污染严重影响环境水质,直接威胁人类和牲畜的健康。粪便污染会严重影响海洋捕捞或游泳等娱乐活动。1 人类和温血动物的粪便中含有病原体,是水传播疾病的主要来源。大多数水传播病原体可以寄居在人类和动物的粪便中。2 识别污染源对于有效的资源管理、补救和潜在环境风险评估至关重要。传统的病原体检测培养方法成本高、耗时、费力,并且由于需要长时间培养,不适合及时预防重大流行病的爆发。3 最近,表面等离子体共振 (SPR)、DNA 微阵列、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、表面等离子体共振 (SPR)、实时
聚合酶链式反应 (PCR) 是一种功能强大且灵敏的 DNA 扩增技术 (1)。Taq DNA 聚合酶是一种广泛用于 PCR 的酶 (2)。以下指南旨在确保使用 NEB 的 Taq DNA 进行 PCR 成功
6 将 100 μl 或 200 μl 移液器调至 80 μl,然后上下移取整个体积至少 10 次以充分混合。快速旋转以收集管壁上的所有液体 注意:NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 粘稠。应注意确保充分混合连接反应,因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡的存在不会影响性能。
聚合酶链式反应 (PCR) 是一种功能强大且灵敏的 DNA 扩增技术 (1)。Taq DNA 聚合酶是一种广泛用于 PCR 的酶 (2)。以下指南旨在确保使用新英格兰
使用针对CMV基因组高度保守区域的特异引物对聚合酶UL54基因进行测序。所有目标序列(包括 IC)均使用通用 PCR 扩增谱同时扩增。病毒载量是通过与标准化 IC(非 CMV DNA)进行比较来确定的,IC 除了作为提取和扩增控制外,还可作为定量标准。此外,每次运行都会添加低滴度阳性对照、高滴度阳性对照和阴性对照。这些对照均根据 CMV WHO 国际标准进行校准。参与 EKE:QCMD 干扰:血清可能低估病毒载量,应避免。
描述各种方法用于实时PCR(定量PCR或QPCR)数据的统计分析和图形表示。'rtpcr'负责基于多达两个参考基因的实时PCR数据的扩增效率计算,统计分析和图形表示。通过考虑放大效率值的考虑,“ RTPCR”是由Ganger等人描述的一般计算方法开发的。(2017)和Taylor等。(2019),涵盖了livak和pfaffl方法。基于实验条件,“ RTPCR”包装的功能使用t检验(用于具有两级因子的实验),方差分析(ANOVA),协方差分析(ANCOVA)分析(ANCOVA)或重复测量数据分析以计算到calcu- colcu- flta delta delta delta delta delta ct方法(delta cta)或dela dela dela dela(re)(re)(re)。该功能进一步提供了平均值的标准误差和置信度间,采用统计平均比较并具有重要意义。为了促进功能应用,使用了不同的数据集作为示例,并解释了输出。“ RT- PCR”软件包还使用各种控制参数提供条形图。“ rtpcr”包装是用户友好且易于使用的,并提供了用于分析实时PCR数据的适用资源。
开始之前 ................................................................................................ 7 工作流程示意图 ................................................................................ 7 推荐的检测布局 ................................................................................ 7 样品制备 .............................................................................................. 8 qPCR 检测准备 ................................................................................ 8 阳性对照(可选) ................................................................................ 9 推荐的 PCR 循环方案 ...................................................................... 9 数据收集 ............................................................................................. 9
为了充分发挥基因编辑技术在临床治疗中的巨大潜力,需要彻底评估靶向编辑和非预期编辑的后果。然而,目前缺乏一种全面、流水线化、大规模且经济的工作流程来检测基因组编辑结果,特别是插入或删除大片段。在这里,我们描述了一种通过对条形码长距离 PCR 产物进行纳米孔池测序来有效准确地检测 CRISPR-Cas9 编辑后的多个基因变化的方法。为了克服纳米孔测序的高错误率和插入缺失,我们开发了一种流程,通过对纳米孔扩增子测序 (GREPore-seq) 的读取进行 grepping 来捕获条形码序列。GREPore-seq 可以检测 NHEJ 介导的双链寡脱氧核苷酸 (dsODN) 插入,其准确度与 Illumina 下一代测序 (NGS) 相当。GREPore-seq 还可以识别 HDR 介导的大基因敲入,这与 FACS 分析数据高度相关。还检测到了 HDR 编辑后的低水平质粒骨架插入。我们建立了一个实用的工作流程来识别遗传变化,包括量化 dsODN 插入、敲入、质粒骨架插入和 CRISPR 编辑后的大片段缺失。该工具包用于对汇集的长扩增子进行纳米孔测序,在评估靶向 HDR 编辑和超过 1 kb 的意外大插入缺失方面应具有广泛的应用。GREPore-seq 可在 GitHub 上免费获取(https://github.com/lisiang/GREPore-seq)。
• ISO 16577 - “Molecular biomarker analysis — Terms and definitions” • ISO 20813 - “Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification of animal species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and definitions” • ISO 21571 – “Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction” • ISO 24276 – “Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — General requirements and definitions” • ISO 20224 – “Molecular biomarker analysis Detection of animal-derived materials in foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR” • CEN/TS17329-1:2019 - “Foodstuffs – General guidelines for the定性实时PCR方法的验证”•法典Alimentarius委员会文档CAC/GL 74-2010-“关于性能标准的指南以及对食物中特定DNA序列和特定蛋白质的检测,鉴定和量化的验证”•US-FDA文档的特定DNA序列和特定蛋白