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对人类原代自然杀伤细胞的基因操作......
淋巴结外自然杀伤 (NK)/T 细胞淋巴瘤，鼻型 (ENKTCL) 是一种高度侵袭性的淋巴瘤，其中肿瘤抑制基因 PRDM1 经常丢失或失活。我们采用了两种不同的 CRISPR/Cas9 方法来生成 PRDM1 -/- 原代 NK 细胞，以研究该基因在 NK 细胞稳态中的作用。与野生型相比，PRDM1 -/- NK 细胞的克隆效率显著提高、增殖率更高、凋亡更少。基因表达谱显示，在 PRDM1 -/- NK 细胞中，与增殖、细胞周期、MYC、MYB 和 TCR/NK 信号相关的通路显著富集，但与正常细胞功能（包括细胞毒功能）相关的通路被下调，这表明 PRDM1 的缺失使 NK 细胞转向增殖和存活，而不是发挥其正常功能。我们还能够进一步修改 PRDM1 缺失的克隆，以引入 ENKTCL 中常见的肿瘤抑制基因（如 TP53、DDX3X 和 PTPN6）的杂合缺失。我们建立了体外模型来阐明 PRDM1 介导其对 NK 细胞的稳态控制的主要途径。这种方法可以应用于研究淋巴瘤发病机制中的其他相关遗传病变和致癌协同作用。
Blimp-1 塑造 IL-21 的表观遗传结构– ...
简介全基因组关联研究已发现许多与自身免疫性疾病风险相关的遗传变异。据报道，编码 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (BLIMP1) 的正调节结构域 1 ( PRDM1 ) 基因座的突变与克罗恩病 (CD) 有关。此外，具有 PRDM1 变异的 CD 患者的外周血淋巴细胞 (PBL) 的特征是 T 细胞增殖和 IFN- γ 分泌增加。具有常见 CD 风险相关纯合变异的 CD 患者回肠活检中 PRDM1 的表达低于野生型等位基因纯合的个体 (1)。此外，两项独立的动物研究表明，T 细胞中缺乏 Blimp-1 会增加效应/记忆 T 细胞在外周淋巴器官中的积累并促进自身免疫性结肠炎的发展 (2, 3)，表明其在自身免疫性疾病中发挥抑制作用。此外，我们证明 T 细胞特异性 Blimp-1 缺陷会增加 NOD 小鼠对自身免疫性脑脊髓炎 (4) 的易感性，并导致自发性结肠炎 (5)。此外，T 辅助细胞 1 (Th1) 的表达
在人类原代 B 细胞中高效进行 CRISPR-Cas9 介导的诱变以识别浆细胞调节剂
人类 B 淋巴细胞是自身抗体介导疾病免疫疗法的有吸引力的靶点。基因编辑技术可以提供强大的工具来确定调节 B 细胞分化为浆细胞的基因调控网络，并确定预防和治疗自身免疫性疾病的新治疗靶点。在这里，我们描述了一种新方法，该方法使用 CRISPR-Cas9 技术在体外靶向人类原代 B 细胞中的基因以识别浆细胞调节剂。我们发现 sgRNA 和 Cas9 成分可以通过 RD114 假型逆转录病毒载体有效地递送到人类原代 B 细胞中。使用该系统，我们实现了大约 80% 的基因敲除效率。我们破坏了三种转录因子 IRF4、PRDM1 和 XBP1 的表达，并表明人类 B 细胞存活和浆细胞分化受到严重损害。具体而言，IRF4、PRDM1 和 XBP1 在浆细胞分化的不同阶段表达，IRF4、PRDM1 和 XBP1 靶向的 B 细胞分别无法进展到前浆母细胞、浆细胞状态和浆细胞存活。我们的方法为研究原代人类 B 细胞中的基因功能和确定用于治疗应用的新型浆细胞调节剂开辟了一条新途径。
人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
702。CAR-T细胞疗法
T细胞功能障碍，包括记忆力损失和疲劳，是CAR T细胞疗法功效的主要局限性。在CAR T细胞中操纵转录因子（TF）活性，例如过表达FOXO1和JUN或PRDM1和NR4A3的消融，可以改善其在肿瘤控制过程中的衰竭分化和记忆丧失。这表明长时间的肿瘤暴露可能会导致转录程序失调，以诱导CAR T细胞功能障碍和记忆力丧失。ezh2，催化赖氨酸27（H3K27ME3）在编排多个基因程序表达的H3的三甲基化中，在小鼠中T细胞免疫反应的调节中起着核心作用。然而，是否需要EZH2才能消除肿瘤，以及肿瘤是否靶向T细胞EZH2诱导CAR T细胞功能障碍仍然未知。在这里，我们证明了EZH2是CAR T细胞反应的主要调节剂，对肿瘤控制至关重要，并且在CAR T细胞中强迫表达耐磷酸化的EZH2的EZH2使它们具有增强的能力，可抵抗肿瘤诱导的功能障碍和记忆损失。
CRISPR/CAS9介导的屏幕确定早期浆细胞分化的决定因素
Results: Among known genes whose deletion preferentially or mostly affected plasmablast formation were the transcription factors Prdm1 (BLIMP1), Irf4 and Pou2af1 (OBF-1), and the Ern1 gene encoding IRE1a, while deletion of XBP1, the transcriptional master regulator that speci fi es the expansion of the secretory program in plasma cells, had no effect.由ERN1缺失引起的缺陷浆形形成无法通过XBP1的活跃的，拼接的形式来挽救其处理取决于IRE1A的下游和下游，这表明在早期的血浆细胞分化中，IRE1A在XBP1独立于XBP1独立于XBP1。此外，我们刚鉴定出涉及NF-KB信号传导（NFKBIA），囊泡Traffiffiffiffiking（ARF4，PERB）和表观遗传调节剂的几个基因，这些基因构成了NURD COMPLEX（HDAC1，MTA2，MBD2）的一部分。ARF4的缺失，ARF4是Copi囊泡形成所需的小GTPase，浆膜形成受损和抗体分泌阻塞。HDAC1缺失后，浆质分化始终降低约50％，而密切相关的HDAC2基因的缺失无效。HDAC1敲除导致控制浆细胞与B细胞身份的拮抗转录因子的强烈扰动蛋白表达（通过降低IRF4和Blimp1以及增加Bach2和Pax5）。