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World File Search SystemPROTACS
PROTAC 分子介导的 SpCas9 蛋白降解用于精准基因组编辑 孙胜男 1,3 , 孙仁红 2,3 , 谭敏康 1 , Maarten Kip 1 , X
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CRISPR 激活筛选将 FBXO22 鉴定为支持靶向蛋白质降解的 E3 连接酶
靶向蛋白质降解 (TPD) 代表了一种有效的化学生物学范例，它利用细胞降解机制以药理学方式消除特定的目标蛋白质。尽管已发现多种 E3 连接酶可促进 TPD，但仍迫切需要使可用于此类应用的 E3 连接酶库多样化。这种扩展将扩大潜在蛋白质靶标的范围，以适应具有不同亚细胞定位和表达模式的靶标。在本研究中，我们描述了一种基于 CRISPR 的转录激活筛选，重点是人类 E3 连接酶，目的是识别可以促进异双功能化合物介导的靶标降解的 E3 连接酶。这种方法使我们能够解决在缺乏所需 E3 连接酶或所需 E3 连接酶水平较低的特定细胞系中研究候选降解分子的局限性。通过这种方法，我们确定了一种候选的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，22-SLF，当 FBXO22 基因转录被激活时，它会诱导 FKBP12 的降解。22-SLF 以 FBXO22 依赖的方式在多种癌细胞系中诱导内源性 FKBP12 的降解。后续的机制研究表明，22-SLF 与 FBXO22 中的 C227 和/或 C228 相互作用以实现目标降解。最后，我们通过有效降解另一种内源性蛋白质 BRD4 证明了基于 FBXO22 的 PROTAC 的多功能性。这项研究揭示了 FBXO22 是一种 E3 连接酶，能够通过亲电 PROTAC 支持配体诱导的蛋白质降解。我们开发的平台可以通过识别促进小分子诱导或内源性蛋白质降解的 E3 连接酶来轻松应用于阐明蛋白质降解途径。
针对嵌合细胞外囊泡的蛋白水解用于治疗三阴性乳腺癌的治疗开发
蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 是一种新兴的癌症靶向治疗方法，但由于细胞靶向性和穿透性较差以及体内不稳定性，PROTAC 的广泛临床应用受到限制。为了克服这些问题并提高 PROTAC 药物的体内疗效，开发了基于微流控液滴的电穿孔 (µDES) 作为一种新型细胞外囊泡 (EVs) 转染系统，可实现高效的 PROTAC 装载和体内有效递送。我们之前开发的 YX968 PROTAC 药物已显示出对 HDAC3 和 8 的选择性降解，通过双重降解有效抑制乳腺肿瘤细胞系（包括 MDA-MB-231 三阴性乳腺癌 (TNBC) 系）的生长，而不会引起整体组蛋白高乙酰化。在本研究中，我们证明基于 µDES 的 PROTAC 在 EVs 中的装载显着增强了 PROTAC 药物在 TNBC 乳腺肿瘤小鼠模型中的体内治疗功能。 NSG 小鼠已建立 MDA-MB-231 肿瘤，并通过腹膜内注射 EVs 进行肿瘤抑制研究，结果显示 HDAC 3 和 8 降解效率和肿瘤抑制率明显高于仅使用 PROTAC 的组。收集肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏和脑进行安全性测试，结果显示毒性有所改善。PROTAC 药物的 EV 递送提高了药物在体内的稳定性和生物利用度、可运输性和药物靶向能力，填补了 PROTAC 治疗功能在体内和临床转化中当前发展的重要空白。这种基于 EV 的新型药物转染和递送策略可应用于各种疗法，以增强体内递送、功效和安全性。
bcl-xl tr-fret分析套件
图1。BCL-XL TR-FRET分析套件原理的例证。含有Terbium标记的供体，染料标记的受体，BCL-XL，肽配体和抑制剂的样品孵育180分钟。抗His标记的供体与他标记的BCl-XL结合。Bcl-XL肽配体用生物素标记，该配体允许染料标记的链霉亲和蛋白受体与Bcl-XL肽配体结合。这导致了从Terbium到受体的Terbium激发后的能量转移。使用能够TR-FRET读数的荧光板读取器测量荧光强度，而620-665 nm的增加直接对应于Bcl-XL与Bcl-XL肽配体的相互作用。背景BCl-XL（B-Cell淋巴瘤 - 巨大），也称为BCl2L1，是Bcl-2蛋白质家族的成员，参与调节细胞凋亡。bcl-XL是Bcl-2蛋白的一部分，即被认为是促生物蛋白的蛋白，就像与其效应蛋白结合时，它们会抑制细胞凋亡。bcl-XL在线粒体膜的渗透性中起作用，允许细胞色素释放C。除了其在凋亡中的作用外，它还参与了神经生长，突触可塑性和神经保护作用。顾名思义，它们在B细胞淋巴瘤中的水平异常，可能有助于该疾病的进展。BCl-XL过表达在大约80％的淋巴瘤中发现，因此在癌症治疗中是一个有吸引力的靶标。最近，它通过控制免疫细胞，成纤维细胞和其他细胞类型的凋亡率来确定为自身免疫性疾病和衰老的参与者。已经探索了几种治疗方法，靶向BCl-XL，范围从小抑制剂（例如Navitoclax）到Protac（靶向嵌合体）。Protac 753b，一种针对Bcl-XL/BCl2对VHL（Von Hippel-Lindau）的Protac，已显示出可以增加化学疗法的影响，同时避免脱靶对血小板的脱靶作用，因为这些效果不表达VHL。小型抑制剂的进步也正在进行中，并有望为肿瘤学患者带来好处。
利用化学蛋白质组学平台重新构想药物可行性
CONSPECTUS：现代药物发现工作中最大的瓶颈之一是解决不可用药的蛋白质组。目前，超过 85% 的蛋白质组仍然被认为是不可用药的，因为大多数蛋白质缺乏明确的结合位点，而这些位点无法用小分子进行功能性靶向。解决不可用药的蛋白质组需要创新方法来发现针对不可用药蛋白质的配体，以及开发新的治疗方法来功能性地操纵感兴趣的蛋白质。化学蛋白质组学平台，特别是基于活性的蛋白质分析 (ABPP)，已经出现，通过使用基于反应性的化学探针和先进的基于定量质谱的蛋白质组学方法来发现“可配体热点”或可以用小分子配体靶向的蛋白质组范围的位点，以解决不可用药的蛋白质组问题。随后，这些位点可通过共价配体进行药理靶向，以快速发现针对目标治疗性蛋白质的功能性或非功能性结合剂。化学蛋白质组学方法还揭示了对配体能力的独特见解，例如发现独特的变构位点或蛋白质的内在无序区域，这些区域可通过药理学和选择性靶向，以实现生物调节和治疗益处。化学蛋白质组学平台还通过发现几种新的共价 E3 连接酶募集剂，扩大了针对靶向蛋白质降解和蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 的新兴治疗模式的范围。展望未来，化学蛋白质组学方法无疑将对进一步扩展现有研究产生重大影响，包括蛋白质组范围的配体可定位性、针对高价值非药物治疗靶点的靶向配体发现、进一步扩大靶向蛋白质降解平台的范围、发现能够独特调节蛋白质功能的新分子胶支架，以及最令人兴奋的是开发下一代小分子诱导邻近治疗模式，这些模式超越了降解。随着化学生物学成为药物发现越来越重要的驱动力，该领域将迎来激动人心的一天，化学蛋白质组学方法必将成为开发下一代疗法的支柱。■ 主要参考文献
宿主-病原体界面的靶向蛋白质降解
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格雷戈里·W·凯罗
我是耶鲁大学化学系的博士生，也是美国国家科学基金会的研究员。我的研究涉及机器学习方法在药物发现中的开发和应用。我创建了 HAC-Net，这是目前最先进的预测蛋白质-配体结合亲和力的机器学习模型。我开源了所有代码，创建了一个 Python 包和笔记本以及相应的演示视频，并发表了一篇论文，以便更广泛的科学界可以轻松使用此工具。尽管该模型是最近才开发的，但据报道，它有助于识别一种用于治疗耐药性葡萄球菌感染的潜在抗毒力药物。不久之后，我创建了 ChemSpaceAL，这是第一种针对特定蛋白质靶标微调分子生成模型的主动学习方法，特别适用于创建蛋白质靶标特异性分子库以用于药物发现中的虚拟筛选。最近，我创建了 CardioGenAI，这是一个基于机器学习的框架，用于重新设计开发中和上市的药物，以降低心脏毒性，同时保留其药理活性。该框架结合了新颖的最先进的判别模型，用于预测 hERG、Na V 1.5 和 Ca V 1.2 通道活性，这些模型也可以独立作为早期虚拟筛选流程的有效组成部分。此外，我还开发了一种描述蛋白质内信息传递的方法，即静电耦合在基于二级结构元素的网络中传播，这种方法为了解 CRISPR-Cas9、咪唑甘油磷酸合酶和 D-多巴色素互变异构酶等多种重要生物系统的变构机制提供了宝贵的见解。此外，我还为基于量子计算的小分子研究方法的开发做出了贡献，并在一家世界知名的科学软件公司开发了用于 PROTAC 筛选的软件。我在顶级学术期刊上发表了多篇论文，在多个会议上展示了我的工作，创建了多个 Python 包，与世界各地的实验室建立了各种合作关系，并在耶鲁大学成立了生物物理学会分会。出于这些原因，我获得了多个极负盛名的奖项，并多次出现在耶鲁新闻中。教育
PROTAC：一种有效的癌症治疗靶向蛋白质降解策略
化疗作为传统的治疗方法，在癌症治疗过程中发挥着不可替代的作用。传统抗癌药物的主要缺点是大多选择性差、易产生耐药性（Mangal et al., 2017; Dong et al., 2020; Yuan et al., 2020），因此癌症的靶向治疗引起了人们的重视（Zhou Y. et al., 2020; Qi et al., 2020; Yu et al., 2020）。在此基础上，新靶点和小分子抑制剂（SMI）的发现成为强有力的治疗策略（Dong et al., 2018）。尤其是小分子激酶抑制剂的开发成为药物发现过程中最受广泛追捧的领域之一，并在癌症治疗中取得了巨大成就（Wu et al., 2015）。然而该治疗策略在成功之后也面临着与化疗同样的耐药性问题（ Dong et al., 2020 ; Xu et al., 2020 ）。因此，耐药性是癌症治疗的主要限制，亟待解决。近年来，一种针对疾病相关蛋白质进行降解的新策略引起了极大的关注。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），也称为二价化学蛋白质降解剂，是一种通过 E3 泛素连接酶途径降解特定内源蛋白质的异双功能分子（ Potjewyd et al., 2020 ）。它通过适当的连接子在结构上将目的蛋白（POI）结合配体与E3泛素连接酶（E3）配体连接起来（Buckley et al., 2015; Zhang et al., 2019; Kregel et al., 2020; Vollmer et al., 2020）。PROTAC技术的潜在优势可能弥补传统药物治疗的不足，从而促进其快速发展（Toure and Crews, 2016; Sun and Rao, 2020）。本文重点介绍PROTAC技术的机制、研究进展，并总结该降解方法的优势。
靶向蛋白质降解揭示 BET 溴结构域是 Hedgehog 通路抑制剂-1 的细胞靶标
*通讯地址：sascha.hoogendoorn@unige.ch 摘要 从表型筛选中得到的小分子命中物的靶标反卷积是一项重大挑战。许多筛选都表明，人们已进行许多筛选来寻找 Hedgehog (Hh) 信号通路的抑制剂，Hedgehog (Hh) 信号通路是一条与健康和疾病有着诸多关系的主要发育通路，其中有许多命中物但很少有确定的细胞靶标。我们在此提出一种基于蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 结合无标记定量蛋白质组学的靶标识别策略。我们开发了一种基于下游 Hedgehog 通路抑制剂-1 (HPI-1) 的 PROTAC，HPI-1 是一种具有未知细胞靶标的表型筛选命中物。使用我们的 Hedgehog 通路 PROTAC (HPP)，我们确定并验证了 BET 溴结构域是 HPI-1 的细胞靶标。此外，我们发现 HPP-9 通过延长 BET 溴结构域降解时间，具有作为长效 Hh 通路抑制剂的独特作用机制。总之，我们提供了一种强大的基于 PROTAC 的靶标反卷积方法，该方法回答了 HPI-1 的细胞靶标这个长期存在的问题，并产生了第一个作用于 Hh 通路的 PROTAC。主要 Hedgehog 通路是一个复杂的细胞信号级联，可调节胚胎发育过程，例如模式化，以及干细胞维持和组织稳态。1,2 Hedgehog 信号转导生理水平的失调会导致发育障碍以及各种癌症的发生和进展，最显著的是基底细胞癌和髓母细胞瘤。3,4 正常条件下的通路激活是由其中一种 Hedgehog 蛋白 (IHH、DHH、SHH) 与受体 Patched (PTCH1) 结合启动的。 5–7 HH 与 PTCH1 结合可释放后者对 Smoothened (SMO) 的抑制作用。8,9 进一步的激活步骤包括与融合抑制因子 (SUFU) 结合的 GLI2/3 转录因子通过初级纤毛的尖端运输并积累。10–13 GLI 转录因子加工成其转录活性形式，然后导致 Hedgehog 靶基因的转录，其中包括正调节剂 Gli1 和负反馈回路中的 Ptch1。14,15 目前，唯一获得临床批准用于对抗 Hh 通路驱动癌症的药物是针对 SMO（vismodegib、sonidegib）的药物。由下游通路激活驱动的癌症本质上对这些药物不敏感，并且最初有反应的肿瘤获得性耐药很常见。16–
Bardoxolone 结合可实现 BRD4 的靶向蛋白质降解
靶向蛋白质降解 (TPD) 已成为一种强大的药物发现治疗方式 1 – 11 。实现这种治疗方式的一种策略是采用称为降解剂或蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 的异双功能小分子，其由三个组成部分组成：E3 连接酶募集剂；连接子；以及用于靶向目的蛋白 (POI) 的配体。通过将 E3 连接酶募集到 POI，所得的 PROTAC 能够以蛋白酶体依赖的方式诱导 POI 泛素化和降解（图 1 A）1 – 11 。虽然这种治疗方式具有巨大的潜力，但该领域面临的一个主要挑战是，尽管预测的 E3 连接酶超过 600 种，但仅鉴定出少数 E3 连接酶募集剂。已知和流行的 E3 连接酶募集剂包括募集 cereblon (CRBN) 的沙利度胺类免疫调节药物 (IMiD)、von-Hippel Lindau (VHL) E3 连接酶的羟脯氨酸基配体、与 MDM2 结合的 nutlins 以及针对 cIAP 的配体 (图 1 B) 1 – 15 。虽然这些募集剂可逆地与其相应的 E3 连接酶结合，但最近的研究表明，可以共价靶向 E3 连接酶的反应性小分子也可以用作 E3 连接酶募集模块，以在 TPD 应用中有效降解靶蛋白。这些亲电部分包括萜烯天然产物印楝素的衍生物，它可以共价结合 E3 连接酶 RNF114 上的无序半胱氨酸，CCW16 可以与 E3 连接酶 RNF4 上的锌配位半胱氨酸反应，KB02 可以共价靶向 cullin E3 连接酶 DCAF16（图 1B）16-19。共价 E3 连接酶募集剂有可能利用蛋白质内大量的亲核氨基酸残基，基于此成功，我们推测共价和可逆的 E3 连接酶募集可能是 PROTAC 开发中第三个尚未充分探索的领域（图 1B）。作为一种可能的作用机制，可逆共价修饰提供了持续靶标结合的潜力，同时避免永久性的蛋白质修饰——考虑到 PROTAC 的催化性质，这一特征特别令人感兴趣。虽然这一概念在药物发现环境中已被证明是强大的 20 – 25 ，但我们不知道它在 E3 连接酶募集方面的成功应用 26 , 27 。本文我们研究了小分子巴多索隆，它具有高反应性但可逆的 α-氰基酮异迈克尔受体，作为探索这一概念的第一个蛋白质降解剂的基础。