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用CRISPR-CAS12和CRISPR-Cas13
摘要：植物中的病毒感染威胁粮食安全。因此，需要简单有效的病毒检测方法，以采用可以防止病毒扩散的早期措施。然而，基于聚合酶链反应（PCR）扩增病毒基因组的当前方法需要实验室条件。在这里，我们利用了CRISPR-CAS12A和CRISPR-CAS13A/D系统来检测三种RNA病毒，即烟草的烟叶病毒，烟草蚀刻病毒和马铃薯病毒X，在Nicotiana Benthamiana植物中。我们应用了CRISPR-CAS12A系统来检测由PCR或等温扩增产生的病毒DNA扩增子，并且在混合感染的植物中也进行了多重检测。此外，我们调整了检测系统以绕过昂贵的RNA纯化步骤，并获得带有横向流条的可见读数。最后，我们应用了CRISPR-CAS13A/D系统直接检测病毒RNA，从而避免了进行前置步骤的必要性，并获得了随病毒载荷缩放的读数。这些方法允许在收获叶片后半小时内进行病毒诊断的性能，因此可能与可灭绝的应用有关。关键词：核酸检测，CRISPR诊断，多重诊断，植物病毒■简介
CRISPR-CAS12A基因组在整个植物水平上使用两个兼容的RNA病毒载体
摘要使用可以在宿主植物中复制并系统地移动的病毒载体以传递细菌CRISPR组件，从而可以在整个植物水平上进行基因组编辑，并避免对劳动力密集型稳定转化的要求。但是，这种方法通常依赖于先前转化的植物，这些植物稳定地表达了CRISPR-CAS核酸酶。在这里，我们描述了使用烟草eTCH病毒（TEV； PotyVirus属）和马铃薯病毒X（PVX; PVX;属Potexvirus）得出的两个兼容的RNA病毒载体的成功无DNA的基因组编辑，这些病毒是在同一细胞中复制的。TEV和PVX载体分别表达CAS12A核酸酶和相应的指导RNA。这种新型的两场媒介系统改善了植物中无病毒诱导的基因组编辑的工具箱，并将促进繁殖更多营养，耐药性和生产性作物的努力。
茄科作物病毒诱导基因组编辑方法的开发
使用 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑 (GE) 彻底改变了植物诱变。然而，传统的转基因介导的 GE 方法存在局限性，因为通过组织培养生成表达 Cas9/单向导 RNA (sgRNA) 模块的稳定转基因系需要花费很长时间。病毒诱导的基因组编辑 (VIGE) 系统已成功用于模型植物，例如拟南芥和烟草属。在本研究中，我们开发了两种用于茄科植物的 VIGE 方法。首先，我们使用烟草脆裂病毒 (TRV) 载体将 sgRNA 递送到表达 Cas9 的转基因番茄 (Solanum lycopersicum) 品种 Micro-Tom 品系中。其次，我们设计了一种基于马铃薯病毒 X (PVX) 载体的非转基因 GE 方法来递送 Cas9 和 sgRNA。我们设计并克隆了靶向八氢番茄红素去饱和酶的 sgRNA，并将其放入 VIGE 载体中，并确定了 VIGE 的最佳条件。我们通过病毒载体接种后对靶基因的深度测序来评估 VIGE 效率，检测到 TRV 和 PVX 介导的 GE 的突变率分别为 40.3% 和 36.5%。为了提高编辑效率，我们采用了 37 ◦ C 热处理，这分别使 TRV 和 PVX 介导的 VIGE 的编辑效率提高了 33% 至 46% 和 56% 至 76%。为了获得编辑植物，我们对接种的子叶进行了组织培养，获得了成功的编辑事件。我们还证明 PVX 介导的 GE 可应用于其他茄科作物，例如马铃薯 (Solanum tuberosum) 和茄子 (Solanum melongena)。这些简单且高效的 VIGE 方法在茄科作物中生成基因组编辑植物方面具有巨大潜力。
利用 RNA 病毒载体对植物基因组进行可遗传的 CRISPR-Cas9 编辑
病毒感染的系统性传播促进了编辑成分在植物组织内的积累。这导致了高效和快速的基因组编辑，从而为评估单向导 RNA (sgRNA) 设计的有效性和特异性提供了理想的筛选工具。几种基于植物 RNA 病毒的复制子已成功用于在组成性表达 Cas9 核酸酶的转基因植物中传递 sgRNA。9–19 然而，每种病毒载体都有自己的分子生物学特性，并且仅限于特定的宿主范围。在这里，我们描述了两种源自马铃薯病毒 X (PVX；Potexvirus 属) 和烟草脆裂病毒 (TRV；Tobravirus 属) 的病毒载体的工程改造，用于在模型物种本氏烟中传递非间隔 sgRNA（图 1）。所提出的 PVX 系统由单个二元载体 pLX-PVX 组成，该载体包含 PVX 基因组序列和一个来自竹花叶病毒 (BaMV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。TRV 系统依赖于 pLX-TRV1 和 pLX-TRV2，这是两个具有兼容来源的 T-DNA 载体，可同时进行病毒基因组成分的农杆菌接种 (JoinTRV)。pLX-TRV1 提供复制酶功能，而 pLX-TRV2 包含一个工程化的 TRV RNA2 序列和一个来自豌豆早褐病毒 (PEBV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。这两个病毒系统均基于 pLX 系列的紧凑 T-DNA 二元载体20，这些载体已成功用于通过农杆菌介导的接种 (农杆菌接种) 启动 RNA 和 DNA 病毒感染。 21–23 重组病毒复制子与 sgRNA 构建体组装并通过农杆菌接种递送到表达 Cas9 的植物中。系统性病毒感染导致生殖系基因组编辑和编辑后代的恢复（图 1）。
使用马铃薯 X 病毒载体中的非间隔 sgRNA 阵列工程进行高效的 Cas9 多重编辑
基于成簇、规则间隔、短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的系统彻底改变了许多生物体（包括植物）的基因组编辑。植物中的大多数 CRISPR-Cas 策略依赖于使用农杆菌进行遗传转化来提供基因编辑试剂，例如 Cas 核酸酶或合成向导 RNA (sgRNA)。虽然 Cas 核酸酶是编辑方法中的恒定元素，但 sgRNA 是靶向特异性的，通常需要筛选过程来识别最有效的 sgRNA。植物病毒衍生载体是将 sgRNA 快速有效地递送到成年植物中的一种替代方法，因为病毒具有基因组扩增和系统运动的能力，这种策略称为病毒诱导的基因组编辑。我们对马铃薯病毒 X (PVX) 进行了改造，以构建一种可在成年茄科植物中轻松表达多个 sgRNA 的载体。使用基于 PVX 的载体，本氏烟基因被有效靶向，在组成性表达化脓性链球菌 Cas9 的转化株系中产生近 80% 的插入/缺失。有趣的是，结果表明 PVX 载体允许表达不间隔 sgRNA 阵列，在成年植物组织中几天内实现高效的多重编辑。此外，可以从受感染组织或受感染植物种子再生的植物中获得无病毒编辑的后代，这些后代表现出高遗传双等位基因突变率。总之，这种新的 PVX 载体可以轻松、快速和高效地表达 sgRNA 阵列以进行多重 CRISPR-Cas 基因组编辑，并将成为跨不同植物物种（尤其是茄科作物）进行功能基因分析和精准育种的有用工具。
柔性修饰的植物病毒纳米颗粒的结合可以增强效应，从而改善骨化
植物病毒纳米颗粒（VNP）经过基因工程为呈现成骨的提示提供了一种有前途的方法，用于在骨组织工程中生物功能化水凝胶。柔性马铃薯病毒X（PVX）纳米颗粒通过呈现RGD基序，羟基磷灰石结合肽（HABP），OREDECTERTY PORIDGLUTAMATES（ORSECTAINS POLITGLUTAMATES（E8）依赖性依赖性依赖性依赖性依赖性的方式），从而大大增强了人间充质干细胞（HMSC）的附着和区分。因此，假设烟草病毒纳米颗粒的功能性肽是PVX的1.6倍，将产生这种影响。这项研究假设在涂有两个VNP的含有两个VNP的肽的表面上培养HMSC，用于细胞附着或矿化，可以进一步增强对骨生成的影响。通过不同的HMSC沉积的钙矿物质增加了两到三倍，而在PVX-RGD/PVX-HABP涂层上生长的HMSC的碱性磷酸酶活性显着超过任何其他VNP组合。通过使用具有不同功能的VNP的组合，在第一次观察到了上添加效应。发现，富裕的VNP几何形状比功能性肽的浓度更为关键。总而言之，各种呈肽的植物VNP表现出增强的增强作用，其显着潜力可有效地在骨组织工程中官能化富含细胞的水凝胶。