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研究菥蓂、菥蓂的种子大小和含油量
莨菪是一种耐寒的覆盖作物，在秋季玉米收获和春季大豆种植之间提供生态系统服务，例如减少土壤侵蚀和养分流失。与传统的覆盖作物不同，田间莨菪在晚春产出成熟的油籽，使农民一年内可以收获两种经济作物。野生莨菪品系已被证明可产出 >1,000 千克/公顷 1 。莨菪种子平均含油 33%（按重量计算），油是一种极好的生物燃料原料。然而，尽管有这些环境和经济效益，莨菪目前受到种子小（1 毫克/粒）的限制，这可能会使种子的种植、收获和处理变得复杂。增加种子大小也会提高油提取效率。除了改进种子大小外，增加种子中的油含量也会提高种植和加工莨菪作为生物燃料原料的经济效益。我们收集了代表北美、欧洲和西亚遗传多样性的野生荠菜种质 2 。通过表征这些种质的种子大小和含油量，我们可以鉴定出有用的改良变种。在美国农业部国家油脂研究所的资助下，我们之前开发了几种 EMS 诱导的荠菜突变株系，这些突变株系表现出关键的驯化性状，如种荚破碎减少、开花提早和脂肪酸谱改善 3 。我们还通过生成种子油中芥酸含量无法检测到的荠菜株系，开发并展示了荠菜农杆菌介导的植物转化和 CRISPR-Cas9 基因组编辑的效用 4 。利用这些最近开发的技术和种质，我们的目标是鉴定和表征可提高荠菜作为生物燃料原料物种的效率和效用，并使种子更易于生产者处理的性状。最后，我们会将这些性状渗入我们的优良育种株系，以开发出油量和种子产量更高的新型荠菜品种。为了实现这些目标，我们编制了一个包含 319 个基因型（267 个冬季型和 52 个春季型个体）的葎草关联作图面板。该面板种植在圣路易斯。
CBI删除副本 - 动物和植物健康检查服务
USDA先前已经通过空气过程在此RSR中使用与PTMO相同的表型评估了PennyCress线。在相同的生物合成途径中包含基因（AOP2，[]）中的破坏的线，在其中一些和其他空气请求中评估了与我们的其他编辑[]的表型相同的表型[]。aop2，[]是几种基因的例子，这些基因在破坏时会降低pennycress中的葡萄糖苷水平。此RSR要求对pennycress进行评估，并在其他基因中使用突变，从而导致相同的低葡萄糖苷表型，[]。响应于几个先前提交的空气信件中的每一个，BRS放大了带有AOP2，[]和其他基因中断的Pennycress线，结论是：“……您的基因组编辑的Pennycress系列本身并不是植物的植物”。USDA在几封空气响应信中还指出，根据7 CFR第360部分，Pennycress不会被列为联邦有害杂草，而USDA没有理由相信PennyCress线的预期表型会增加pennycress的杂草。
请求确认 CoverCress, Inc 的豁免
包含机密商业信息 尊敬的副局长 Juarez， CoverCress Inc. (CCI) 谨请求美国农业部动植物卫生检验局生物技术监管服务部 (BRS) 确认我们使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术开发的基因组编辑菥蓂 (Thlaspi arvense) 植物品系的监管状态。CCI 正在开发可将菥蓂用作新型油籽作物的技术。菥蓂不在美国农业部联邦有害杂草名单上，在多个州被认定为作物。此请求描述了一种通过改变种子成分提高了产品质量的 CCI 产品。由此产生的植物将在 [ ] 基因中具有一个单一的基因修饰，该修饰通过过早的终止密码子导致基因功能丧失，这可以通过常规育种方法获得。
Cas9 的效率、特异性和温度敏感性...
使用 CRISPR-Cas 核糖核蛋白 (RNPs) 转染递送基因组编辑试剂比基于质粒 DNA 的递送方法具有多种优势，包括减少脱靶编辑效应、减轻非天然 DNA 片段的随机整合、不依赖载体构建以及监管限制较少。与在动物系统中的使用相比，RNP 介导的基因组编辑在植物中仍处于早期发展阶段。在本研究中，我们建立了一个高效、简化的基于原生质体的 CRISPR-Cas RNP 递送基因组编辑平台，然后评估了六种 Cas9 和 Cas12a 蛋白的效率、特异性和温度敏感性。我们的结果表明，Cas9 和 Cas12a RNP 递送在不同温度条件下（22°C、26°C 和 37°C）均导致基因组编辑频率（8.7 – 41.2%），并且没有明显的温度敏感性。 LbCas12a 通常表现出最高的活性，而 AsCas12a 表现出更高的序列特异性。CRISPR-Cas RNPs 在 22° 和 26°C（植物转化和组织培养的首选温度）下的高活性导致原生质体再生愈伤组织和在下一代恢复可遗传突变体的植物中具有高诱变效率（34.0 – 85.2%）。这种 RNP 递送方法进一步扩展到菥蓂 ( Thlaspi arvense )、大豆 ( Glycine max ) 和狗尾草，诱变频率高达 70.2%。总之，这项研究为选择 RNP 试剂以实现植物中有效的无转基因基因组编辑提供了启示。