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任何站点附近果蝇基因组的无疤痕工程...
我们描述了一种简单而有效的技术，该技术允许在任何包含倒置ATTP盒的着陆点附近对果蝇基因组序列进行无疤痕的工程，例如模拟插入。这种两步方法结合了PHIC31积分酶介导的位点特异性和归纳核酸酶介导的局部重复分辨率，有效地将原始的着陆点等位基因转换为修改等位基因，仅具有所需的变化。纳入此方法中的主要标记允许在每个步骤中对正确的单个平流进行效率。原则上，单个ATTP站点和FRT站点也是有效的着陆点。鉴于较大且越来越多的着陆点线可用，因此该方法提供了一种简单而快速的方法，可以以无忧的方式对大多数果蝇基因组进行有效编辑。此技术也应适用于其他物种。
系统地发现重组酶，以便将大型 DNA 序列有效整合到人类基因组中
大型丝氨酸重组酶 (LSR) 是一种 DNA 整合酶，可促进移动遗传元件在细菌基因组中的位点特异性整合。迄今为止，只有少数 LSR（如 Bxb1 和 PhiC31）被鉴定，作为人类细胞中 DNA 整合的工具，其效率有限。在这项研究中，我们开发了一种计算方法来识别数千个 LSR 及其 DNA 附着位点，将已知的 LSR 多样性扩大了 100 倍以上，并能够预测它们的插入位点特异性。我们在人类细胞中测试了它们的重组活性，将它们归类为着陆垫、基因组靶向或多靶向 LSR。总体而言，我们实现了比 Bxb1 高出七倍的重组率，基因组整合效率为 40-75%，货物大小超过 7 kb。我们还展示了无病毒的质粒或扩增子文库的直接整合，以改进功能基因组学应用。这种直接从微生物测序数据中系统地发现重组酶的做法，提供了超过 60 种在人体细胞中经过实验表征的 LSR 资源，可用于大负载基因组插入，且不会暴露 DNA 双链断裂。
在胚胎，幼虫和成年斑马鱼中高效的他莫昔芬可诱导的Cre重组
在成人生物体中灭活基因功能的能力对于研究诸如再生和行为等生物学过程至关重要。这是通过工程化等位基因来实现的，该等位基因可以使用CRE重组酶有条件地灭活，然后使用药物诱导的CRE重组酶灭活基因功能。最近的一些研究清楚地表明，工程在斑马鱼中的有条件等位基因的可行性。同时，实现足够程度的重组以诱导完全丧失功能的丧失仍然是一个主要限制。在此，我们通过设计由斑马鱼β-Actin2基因的内含子增强子的斑马鱼泛素启动子组成的重组泛素启动子UBB R来解决这一限制。使用PHIC31介导的靶向集成，我们证明了UBB R在所有胚胎和幼虫阶段测试的UBB R显然均优于父母启动子以及目前可用的无处不在的Creer T2驱动线。此外，我们生成的UBB R：CRER T2驱动线使成人斑马鱼心中的Floxed等位基因几乎完全失活。最后，我们证明了我们的UBB R启动子在其他基因组基因座集成时会保留高活性，从而使其独特地适合于斑马鱼的所有阶段的转基因表达。
大规模发现用于将 DNA 整合到人类基因组中的重组酶
最近的微生物基因组测序工作揭示了大量含有整合酶的移动遗传元件，这些整合酶可能成为有用的基因组工程工具。大型丝氨酸重组酶 (LSR)，例如 Bxb1 和 PhiC31，是噬菌体编码的整合酶，可以促进噬菌体 DNA 插入细菌基因组。然而，之前仅鉴定了少数 LSR，它们在人类细胞中的效率有限。在这里，我们开发了一个系统的计算发现工作流程，通过识别数千个新的 LSR 及其同源 DNA 附着位点。我们通过在人类细胞中对 LSR 进行实验表征来验证这种方法，从而产生了三类根据其效率和特异性彼此区分的 LSR。我们识别了可有效整合到与人类基因组正交的合成安装附着位点的着陆垫 LSR、具有计算可预测伪位点的人类基因组靶向 LSR，以及可以单向整合货物的多靶向 LSR，其效率与常用转座酶相似，特异性更高。每个类别的 LSR 在人类细胞中都进行了功能鉴定，总体而言，其质粒重组率比 Bxb1 高出 7 倍，基因组插入效率为 40-70%，载物大小超过 7 kb。总体而言，我们建立了一个范例，用于大规模发现微生物重组酶并直接从微生物测序数据重建其靶位。该策略提供了丰富的资源，包括 60 多种经过实验鉴定的 LSR，这些 LSR 可以在人类细胞中发挥作用，以及数千种额外的候选 LSR，可用于大负载基因组编辑，而不会暴露 DNA 双链断裂。
通过引入 DS-Red、Rec、Rep 和 CRISPR/Cas9 表达构建体获得棉花 (Gossypium hirsutum L.) 创始转化子，用于开发重组酶介导的基因堆积基线
棉花是世界主要的纤维作物，面临着众多生物和非生物胁迫。棉花的基因转化对于满足世界粮食、饲料和纤维需求至关重要。通过随机转移基因进行的基因操作产生了可变的基因表达。通过最新的基因组编辑工具进行有针对性的基因插入会导致基因在特定位置可预测的表达。基因堆叠技术是一种适应性策略，它通过同时在特定位点整合 2-3 个基因来避免在不同位置产生可变的基因表达，从而对抗生物和非生物胁迫。这项研究解释了棉花创始转化子的开发，以用作多基因堆叠项目的基线。我们引入了 Cre 和 PhiC31 介导的重组位点来指定传入基因的位点。整合了 CRISPR-Cas9 基因以开发基于 CRISPR 的棉花创始系。Cas9 基因与 gRNA 一起整合以靶向棉花卷叶病毒的 Rep（复制）区域。病毒的复制区域被专门针对以减少进一步的增殖并防止病毒发展出新的菌株。为了成功开发这些原代转化体，已经使用红色可视化（DS-Red）优化了模型转化系统。根据红色转化系统，已经开发了具有重组指定位点（Rec）、目标复制区域（Rep）和Cas9创始系的三个基线。这些创始转化体可用于开发重组酶介导和基于CRISPR/Cas9的棉花起源系。此外，这些转化体将为所有重组酶介导的基因堆叠项目建立一个基础系统。