XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemPiggybac
走廊中的海报演示（有关详细信息，请参见下文）
可靠的tRNA签名分析：用于早期诊断非小细胞肺癌早期诊断的新型液体活检1:15 min seok han探索方法，用于piggybac transposase的定向进化1:30海顿·霍尔蒙德（Hayden Holmlund
使用TcBuster™ (TcB-M™) 转座酶实现高效...
基因组工程工具的快速发展推动了多种免疫和干细胞疗法进入临床试验，目的是产生自体和同种异体疗法。这些疗法中的许多都使用病毒载体来运送治疗货物。然而，病毒介导的疗法具有免疫原性、货物大小限制、整合位点风险、制造延迟的风险，并且成本极高。虽然有两种已知的非病毒转座酶系统 piggyBac ® 和 Sleeping Beauty ™ ，但两者都被专门授权用于细胞疗法，不能用于商业用途。TcBuster-M ™ (TcB-M ™ ) 是一种可商购的非病毒转座酶编辑平台，可克服当前的病毒限制。TcBuster 存在于赤拟谷盗中，是 hAT 转座酶家族的成员。利用定向进化，我们设计了一种高活性突变体 (TcB-M)，使用更少的 mRNA 转座酶和 Nanoplasmid ™ DNA 转座子提高了转座率。与用于构建 piggyBac 和 Sleeping Beauty 高活性酶的工程努力不同，我们在哺乳动物细胞中使用了一种新型高通量筛选平台。这使我们能够筛选一个包含 >300 万个变体的突变体库，这比用于构建 PiggyBac 或 Sleeping Beauty 的突变体库大得多。这导致构建了用于设计原代免疫细胞的最有效的转座酶系统。TcB-M 允许快速制造细胞，并且细胞制造成本有限。目前，从载体图谱到 GMP 转座子的 TcB-M 时间约为 6-8 个月。由于 TcB-M 受货物尺寸的限制较少，我们可以设计大型多顺反子转座子，以便在各种细胞类型中稳定地递送多种蛋白质，包括原代 T 细胞和 NK 细胞、间充质干细胞和诱导性多能干细胞 (iPSC)。此外，TcB-M 可以轻松与内切酶（如 CRISPR 试剂）结合，以生成组合敲除/过表达编辑细胞产物。改进的 TcB-M 使原代 T 细胞和外周血来源的 NK 细胞中的货物整合率超过 60%，而不会牺牲细胞生长或克隆优势问题。最后，我们对慢病毒、piggyBac 和 Sleeping Beauty 工程化 CAR-T 进行了直接比较，表明 TcB-M 工程化 CAR-T 具有同等或更高的整合百分比。TcB-M 还具有更安全的整合特性，因为与慢病毒相比，它更随机地整合到基因组中，而没有对活性位点的偏好。总体而言，TcB-M 是一种广泛可用、经过验证的非病毒基因编辑技术，可在多种细胞类型中递送大量或难以处理的治疗物质。TcB-M 减少了许多病毒介导的编辑障碍，从而可以更快地生成关键的治疗方法并将其推向市场。
全基因组 CRISPR 筛选揭示了家蚕细胞活力和抗非生物和生物胁迫所必需的基因
高通量基因筛选是一种强大的方法，可用于在全基因组范围内研究基因功能并识别对某些压力负责的基因。在这里，我们开发了一种 piggyBac 策略，可将汇集的 sgRNA 文库稳定地递送到细胞系中。我们使用这种策略在家蚕细胞中进行基于全基因组成簇的规律间隔短回文重复技术 (CRISPR)-Cas9 的筛选。我们首先构建了一个包含 94,000 个 sgRNA 的单向导 RNA (sgRNA) 文库，该文库靶向 16,571 个蛋白质编码基因。然后，我们使用 piggyBac 转座子在 BmE 细胞中生成敲除集合。我们确定了 1006 个在正常生长条件下对细胞生存至关重要的基因。在已确定的基因中，82.4%（829 个基因）与七种动物物种中的必需基因同源。我们还确定了 838 个基因，它们的缺失促进了细胞生长。接下来，我们分别使用温度和杆状病毒对生物或非生物胁迫进行了针对特定环境的阳性筛选，从每个筛选中确定了几个关键基因和途径。总之，我们的结果为家蚕基因组的功能注释和解释导致各种条件的关键基因提供了一个新颖而通用的平台。这项研究还展示了在非模式生物中进行全基因组 CRISPR 筛选的有效性、实用性和便利性。
CHOlympian 平台结合转座酶...
平台，我们首先利用 Cas-CLOVER 开发了一种敲除谷氨酰胺合成酶 (GS) 基因的新型悬浮 CHO K1 细胞系。广泛使用的 GS 敲除策略允许在用于 GS 拯救的相同质粒构建体上引入目的基因时对其进行扩增。大约 35% 的 GS 敲除候选细胞的两个等位基因都被 Cas-CLOVER 灭活。在建立稳定的 GS 敲除 CHO 细胞系后，我们开始针对利妥昔单抗 2（一种研究充分的 IgG1）进行抗体生产，作为测试案例。使用 piggyBac® 转座酶系统稳定整合了编码具有 GS 标记的利妥昔单抗重链和轻链的构建体。Solentim VIPS
通过原位转化的脑室区域神经干细胞的原位转化
This protocol describes the surgical procedure for co-electroporation of two plasmids targeting neu- ral stem cells (NSCs) in the lateral ventricle of mouse postnatal day 2 (P2) pups: a nonintegrating plasmid encoding for the piggyBase transposase and Cas9 and an integrating piggyBac vector car- rying the oncogenes, CRISPR guide RNAs and a TDTOMATO荧光报告蛋白通过倒末端重复序列（ITRS）倾斜（图1）。在电穿孔后，瞬时CAS9表达会导致肿瘤抑制基因失活，而PiggyBase介导的PIG-GYBAC货物的整合确保了靶向NSC及其后代中的癌基因和流动性记者的稳定表达。的整合是由PiggyBase转疗的酶促活性介导的，该转移的酶活性通过切割和粘贴机制在受体细胞基因组中的TTAA位点识别并将其与它们的内容一起插入。NSC的靶向是通过最小的人GFAP（HGFAPMIN）启动子序列1-3驾驶PiggyBase/cas9的驱动表达来实现的。
suzukii果蝇中的高效诱导型CRISPR-CAS9基因靶向
摘要：斑点的果蝇（果蝇苏木木松木）是东亚的原生，但已成为对水果生产的全球威胁。近年来，在该物种中建立了CRISPR/CAS9靶向，允许进行功能性基因组和遗传控制研究。在这里，我们报告了D. suzukii表达Cas9菌株的产生和表征。使用含有EGFP荧光标记基因的Piggybac构建体生成了五个独立的转基因线，而在D. melanogaster Heat Hote Hote蛋白70启动子和3'UTR的控制下，Cas9基因在CAS9基因下产生。热震（HS）处理的胚胎，揭示了转基因CAS9表达的强热诱导性。通过将靶向EGFP的GRNA注入一条选定的线中，G 0倍的50.0％显示出镶嵌的荧光表型，而G 0倍的G 0倍产生的G 1突变体没有HS。通过应用HS，这种体细胞和种系诱变率分别增加到95.4％和85.7％。接受HS的父母植物导致其后代的突变遗传（92％）。另外，针对内源基因黄色导致色素沉着和男性致死性。我们讨论了这些效率和温度依赖性CAS9菌株的潜在用途用于铃木D. suzukii中的遗传研究。
简短的演示和海报
简短的演示和海报1。使用陀螺仪Gyrolab XP系统支持高通量AAV样品测试。夏洛特·科克希尔（Charlotte Corkhill），保罗·杨（Paul Young），英国Pharmaron。2。通量采样表明高抗体产生CHO细胞的代谢特征。Kate Meeson，Jean Marc Schwartz，Magnus Rattray，曼彻斯特大学；英国比林汉姆（Billingham）的富士夫（Fujifilm Diosynth Biotechnologies）Leon Pybus，富士夫。 3。 将行业领先的数据集与基因组规模的代谢模型集成到指导CHO细胞系工程。 Ben Strain，Cleo Kontoravdi，伦敦帝国学院； Holly Corrigall，Pavlos Kotidis，GSK，Stevenage，英国。 4。 绿色藻类衣原体中的叶绿体工程，用于生产新型重组产品。 Luyao Yang，Saul Purton；英国伦敦大学学院。 5。 哺乳动物细胞培养物中乳酸代谢转移的分子驱动因素。 毛罗·托雷斯（Mauro Torres），埃莉·霍克（Ellie Hawke），安德鲁·海斯（Andrew Hayes），艾伦·J·迪克森（Alan J Dickson），曼彻斯特大学； Robyn Hoare，Rachel Scholey，Leon Pybus，Alison Young，Fujifilm Diosynth Biotechnologies，英国Billingham。 6。 使用单个整体可发展性参数合理化mab候选筛选。 Leon F Willis，William Davis Birch，David Westhead，Nikil Kapur，Sheena Radford，David Brockwell，Leeds大学； Isabelle Trayton，Janet Saunders，Maria Bruque，Katie Day，Nicholas Bond，Paul Devine，Christopher Lloyd，Nicholas Darton，Astrazeneca，英国。 7。 用于生物医学应用的磁体鸡尾酒的生物制造和配方。 8。 9。 10。Kate Meeson，Jean Marc Schwartz，Magnus Rattray，曼彻斯特大学；英国比林汉姆（Billingham）的富士夫（Fujifilm Diosynth Biotechnologies）Leon Pybus，富士夫。3。将行业领先的数据集与基因组规模的代谢模型集成到指导CHO细胞系工程。Ben Strain，Cleo Kontoravdi，伦敦帝国学院； Holly Corrigall，Pavlos Kotidis，GSK，Stevenage，英国。 4。 绿色藻类衣原体中的叶绿体工程，用于生产新型重组产品。 Luyao Yang，Saul Purton；英国伦敦大学学院。 5。 哺乳动物细胞培养物中乳酸代谢转移的分子驱动因素。 毛罗·托雷斯（Mauro Torres），埃莉·霍克（Ellie Hawke），安德鲁·海斯（Andrew Hayes），艾伦·J·迪克森（Alan J Dickson），曼彻斯特大学； Robyn Hoare，Rachel Scholey，Leon Pybus，Alison Young，Fujifilm Diosynth Biotechnologies，英国Billingham。 6。 使用单个整体可发展性参数合理化mab候选筛选。 Leon F Willis，William Davis Birch，David Westhead，Nikil Kapur，Sheena Radford，David Brockwell，Leeds大学； Isabelle Trayton，Janet Saunders，Maria Bruque，Katie Day，Nicholas Bond，Paul Devine，Christopher Lloyd，Nicholas Darton，Astrazeneca，英国。 7。 用于生物医学应用的磁体鸡尾酒的生物制造和配方。 8。 9。 10。Ben Strain，Cleo Kontoravdi，伦敦帝国学院； Holly Corrigall，Pavlos Kotidis，GSK，Stevenage，英国。4。绿色藻类衣原体中的叶绿体工程，用于生产新型重组产品。Luyao Yang，Saul Purton；英国伦敦大学学院。 5。 哺乳动物细胞培养物中乳酸代谢转移的分子驱动因素。 毛罗·托雷斯（Mauro Torres），埃莉·霍克（Ellie Hawke），安德鲁·海斯（Andrew Hayes），艾伦·J·迪克森（Alan J Dickson），曼彻斯特大学； Robyn Hoare，Rachel Scholey，Leon Pybus，Alison Young，Fujifilm Diosynth Biotechnologies，英国Billingham。 6。 使用单个整体可发展性参数合理化mab候选筛选。 Leon F Willis，William Davis Birch，David Westhead，Nikil Kapur，Sheena Radford，David Brockwell，Leeds大学； Isabelle Trayton，Janet Saunders，Maria Bruque，Katie Day，Nicholas Bond，Paul Devine，Christopher Lloyd，Nicholas Darton，Astrazeneca，英国。 7。 用于生物医学应用的磁体鸡尾酒的生物制造和配方。 8。 9。 10。Luyao Yang，Saul Purton；英国伦敦大学学院。5。哺乳动物细胞培养物中乳酸代谢转移的分子驱动因素。毛罗·托雷斯（Mauro Torres），埃莉·霍克（Ellie Hawke），安德鲁·海斯（Andrew Hayes），艾伦·J·迪克森（Alan J Dickson），曼彻斯特大学； Robyn Hoare，Rachel Scholey，Leon Pybus，Alison Young，Fujifilm Diosynth Biotechnologies，英国Billingham。6。使用单个整体可发展性参数合理化mab候选筛选。Leon F Willis，William Davis Birch，David Westhead，Nikil Kapur，Sheena Radford，David Brockwell，Leeds大学； Isabelle Trayton，Janet Saunders，Maria Bruque，Katie Day，Nicholas Bond，Paul Devine，Christopher Lloyd，Nicholas Darton，Astrazeneca，英国。 7。 用于生物医学应用的磁体鸡尾酒的生物制造和配方。 8。 9。 10。Leon F Willis，William Davis Birch，David Westhead，Nikil Kapur，Sheena Radford，David Brockwell，Leeds大学； Isabelle Trayton，Janet Saunders，Maria Bruque，Katie Day，Nicholas Bond，Paul Devine，Christopher Lloyd，Nicholas Darton，Astrazeneca，英国。7。用于生物医学应用的磁体鸡尾酒的生物制造和配方。8。9。10。AlfredFernández-Castané，Hong Li，Moritz Ebeler，Matthias Franzreb，Tim W. Overton，Owen R.T.托马斯，阿斯顿大学。 使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。 James Harvey，Yukti Kataria，Titash Sen，Lonza，英国。 使用新型差异氟化和19F NMR研究脂多糖与单克隆抗体之间的相互作用。 詹姆斯·贝奇（James Budge），肯特大学。 使用Amperia生成高产生的克隆人群进行IgG滴定分析。 Matthew Reaney，Zeynep Betts，艾伦·迪克森（Alan Dickson），曼彻斯特大学； Jon Dempsey，Pathway Biopharma Ltd. 11. 脂质体过滤污垢的表征：压力变化对无菌过滤性能的影响。 大力神Argyropoulos，Daniel G. Bracewell，Thomas F. Johnson，UCL； Nigel Jackson，Kalliopi Zourna，Cytiva UK。 12。 一种混合化学计量/数据驱动的方法，可改善细胞内通量预测。 Morrissey J，Barberi G，Facco P，Strain B Kintoravdi C，英国伦敦帝国学院。 13。 无细胞的DNA扩增基因组医学 - 课程的马。 Priya Srivastava，Daniel G. Bracewell，生物化学工程系，UCL；约翰·威尔士（John Welsh），英国Cytiva Europe Limited。 14。 合成生物学方法是为AAV CAPSIDS提高有效负载基因组上传的方法。 Tina Chen，Robert Whitfield，Darren Nesbeth，英国伦敦大学学院。 15。 使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。AlfredFernández-Castané，Hong Li，Moritz Ebeler，Matthias Franzreb，Tim W. Overton，Owen R.T.托马斯，阿斯顿大学。使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。James Harvey，Yukti Kataria，Titash Sen，Lonza，英国。使用新型差异氟化和19F NMR研究脂多糖与单克隆抗体之间的相互作用。詹姆斯·贝奇（James Budge），肯特大学。使用Amperia生成高产生的克隆人群进行IgG滴定分析。Matthew Reaney，Zeynep Betts，艾伦·迪克森（Alan Dickson），曼彻斯特大学； Jon Dempsey，Pathway Biopharma Ltd. 11. 脂质体过滤污垢的表征：压力变化对无菌过滤性能的影响。 大力神Argyropoulos，Daniel G. Bracewell，Thomas F. Johnson，UCL； Nigel Jackson，Kalliopi Zourna，Cytiva UK。 12。 一种混合化学计量/数据驱动的方法，可改善细胞内通量预测。 Morrissey J，Barberi G，Facco P，Strain B Kintoravdi C，英国伦敦帝国学院。 13。 无细胞的DNA扩增基因组医学 - 课程的马。 Priya Srivastava，Daniel G. Bracewell，生物化学工程系，UCL；约翰·威尔士（John Welsh），英国Cytiva Europe Limited。 14。 合成生物学方法是为AAV CAPSIDS提高有效负载基因组上传的方法。 Tina Chen，Robert Whitfield，Darren Nesbeth，英国伦敦大学学院。 15。 使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。Matthew Reaney，Zeynep Betts，艾伦·迪克森（Alan Dickson），曼彻斯特大学； Jon Dempsey，Pathway Biopharma Ltd. 11.脂质体过滤污垢的表征：压力变化对无菌过滤性能的影响。大力神Argyropoulos，Daniel G. Bracewell，Thomas F. Johnson，UCL； Nigel Jackson，Kalliopi Zourna，Cytiva UK。12。一种混合化学计量/数据驱动的方法，可改善细胞内通量预测。Morrissey J，Barberi G，Facco P，Strain B Kintoravdi C，英国伦敦帝国学院。 13。 无细胞的DNA扩增基因组医学 - 课程的马。 Priya Srivastava，Daniel G. Bracewell，生物化学工程系，UCL；约翰·威尔士（John Welsh），英国Cytiva Europe Limited。 14。 合成生物学方法是为AAV CAPSIDS提高有效负载基因组上传的方法。 Tina Chen，Robert Whitfield，Darren Nesbeth，英国伦敦大学学院。 15。 使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。Morrissey J，Barberi G，Facco P，Strain B Kintoravdi C，英国伦敦帝国学院。13。无细胞的DNA扩增基因组医学 - 课程的马。Priya Srivastava，Daniel G. Bracewell，生物化学工程系，UCL；约翰·威尔士（John Welsh），英国Cytiva Europe Limited。14。合成生物学方法是为AAV CAPSIDS提高有效负载基因组上传的方法。Tina Chen，Robert Whitfield，Darren Nesbeth，英国伦敦大学学院。 15。 使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。Tina Chen，Robert Whitfield，Darren Nesbeth，英国伦敦大学学院。15。使用Lonza的GS PiggyBac技术开发了高通量DWP的转染平台。James Harvey，Yukti Kataria，Titash Sen，R＆D Lonza Biologics，英国。 div>
BioproNet2 10月8日至9日第11届年度科学会议...
11:15 – 11:40 Synthetic genetic systems for next-generation biomedicine manufacturing - David James (University of Sheffield) 11:40 – 12:05 Sequence engineering for improved developability of mAbs - Zahra Rattray (University of Strathclyde) 12:05 – 12:15 Rationalising mAb candidate screening with a single holistic developability parameter – Leon Willis (University of Leeds) 12:15 – 12:25 Biomanufacturing and formulation of magnetosome cocktails for biomedical applications - Alfred Fernández-Castané (Aston University) 12:25 -13:15 – ROUND TABLE SESSION: Handling the challenges for bioprocessing 2034 13:15 - 14:05 – POSTER SESSION & LUNCH BREAK 14:05-15:15 – Session 5 – Engineering Biology for Bioprocesssing (Chair – Mark Smales) 14:05 – 14:15 Development of High Throughput Transfection Platform using Lonza's GS PiggyBac Transposase Technology – Titash Sen (Lonza) 14:15 – 14:25 Defining and Manipulating Cellular Mechanisms Underpinning DNA Transfection Efficiency to Enhance Transient Recombinant Protein Production – James Budge (University of Kent) 14:25 – 14:50糖：甜美和简单 - 罗布·菲尔德（曼彻斯特大学）14：50 - 15:15生物生产酵母基因组中的组合设计测试 - 汤姆·埃利斯（帝国学院）会议闭幕，并获得最佳的口头和海报演示
在子宫内电穿孔中，多d缩的基因组 -
位于小鼠大脑皮层中的原生质星形胶质细胞（PRA）紧密并置，在成人阶段形成了明显连续的三维基质。到目前为止，没有免疫染色策略可以将它们单一单一的策略和在成熟动物和皮质生成过程中的形态进行分割。皮质PRA起源于背胸膜中的祖细胞，可以轻松地使用整合载体的子宫电穿孔来靶向。这里提出了一项方案，该方案将这些细胞用可抑制基因组融合的颜色（魔术）标记策略标记，该策略依赖于PiggyBac/ tol2换位和CRE/ LOX重组以随机表达明显的荧光蛋白（蓝色，氰基，黄色和红色），以特定于特异性的亚细胞界面。这种多色命运映射策略使在胶片发生开始之前与颜色标记物的结合可以标记附近的皮质祖细胞，并跟踪其后代，包括星形胶质细胞，从胚胎到各个细胞水平的成人阶段。半parse标记通过调整电穿孔矢量的浓度和颜色对比度的浓度，该颜色可通过多种基因组整合的颜色标记（魔术标记或MM）提供，使星体胶质细胞个性化并将其领土和复杂的形态单一单一单一单一单独化。是一个全面的实验工作流程，包括电穿孔程序的详细信息，通过共聚焦显微镜进行多通道图像堆栈以及计算机辅助的三维分割，这将使实验者能够评估单个PRA的体积和形态。总而言之，魔术标记的电穿孔提供了一种方便的方法，可以单独标记许多星形胶质细胞并在不同的发育阶段访问其解剖特征。该技术对于分析各种小鼠模型中的皮质星形胶质细胞形态特性将是有用的，而无需诉诸于具有转基因报告基因的复杂杂交。
用于人类基因组的强大且多功能的阵列文库...
图 1. APPEAL 克隆。A、从载体 pYJA5 中去除氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)。sgRNA1-4 和甲氧苄啶抗性基因 (TmpR) 与三个不同的 PCR 扩增子融合。所有元件均经过 Gibson 组装以形成 4sgRNA-pYJA5 质粒，并用甲氧苄啶筛选转化子。描绘了 4sgRNA-pYJA5 全质粒和 4sgRNA 盒的详细结构。LTR，长末端重复；Ψ，包装信号序列；PB，piggyBac 转座子元件；PuroR，嘌呤霉素抗性元件；hU6、mU6、hH1 和 h7SK 是普遍表达的 RNA 聚合酶 III 启动子；sg，sgRNA。 B、转化大肠杆菌并进行甲氧苄啶筛选后，代表性 pYJA5 限制性片段、3 片段 PCR 和 APPEAL 克隆产物的单菌落 PCR。Bbs I 消化 pYJA5 产生约 1 千碱基 (kb) 的 AmpR 元件条带和约 7.6 kb 的线性化载体条带（左）。使用相应的 sgRNA 引物进行 PCR 后，三个扩增子在琼脂糖凝胶上分别显示预期的 761、360 和 422 bp 大小（中）。使用转化细菌平板中 APPEAL 克隆产物 4sgRNA 盒两侧的引物进行单菌落 PCR 始终产生预期大小（2.2 kb，右）。 C ，8 个具有不同 4sgRNA 序列的独立 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比（每个实验测试 ≥22 个菌落）。D ，四个 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比。每个点代表一个由八个菌落组成的独立生物复制品（n=24；平均值 ± SEM）。E ，高通量格式的 APPEAL 克隆时间线（h：小时；d：天）。