仅以1 mg/ml的浓度为1 mg/ml,仅PBS(BSA和无叠氮化物)中的未结合的兔重组单克隆抗体,准备结合。使用ProteIntech专有内部重组技术创建。重组生产可以实现无与伦比的批处理一致性,易于扩展和未来的供应安全性。
包含完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche,巴塞尔,瑞士)。将提取物通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,并转移到聚偏二氟化物(PVDF)膜上。膜用5%的非脂肪牛奶或5%牛血清白蛋白(BSA)封闭,然后与针对以下抗原的主要抗体孵育:KRAS:KRAS(#12063-1; Proteintech,Rosemont,Rosemont,IL,IL,USA),PIK3CA,PIK3CA(PIK3CA),PIK3CA(#4249; Celling Signaling Technology; Celling Signaling Technology,Signal,Danvers,Danvers,Ma),Ma,Ma),MA,AKT(29),#29; phospho-AKT (Ser473; #4060; Cell Signaling Technology), MTOR (#2983; Cell Signaling Technology), S6K (#9202; Cell Signaling Technology), phospho-S6K (T389; #9205; Cell Signaling Technology), MEK (#9126; Cell Signaling Technology), ERK (#4695; Cell Signaling Technology), phospho-ERK (Thr202/Tyr204;#4370;细胞信号技术),
Signaling Technology,4129)、细胞周期蛋白 E2 (1:1000; Cell Signaling Technology,4132)、细胞周期蛋白 H (1:1000; BD Biosciences,2927)、裂解的 PARP (1:1000; Cell Signaling Technology,9541S)、CDK2 (1:1000; Santa Cruz,SC6248)、CDK4 (1:1000; Santa Cruz,SC260)、CDK6 (1:1000; Santa Cruz,SC271364)、E-钙粘蛋白 (1:1000; Santa Cruz,SC21791)、N-钙粘蛋白 (1:1000; Santa Cruz,SC7939)、胱天蛋白酶 3 (1:1000; Cell Signaling Technology,14220)、裂解的胱天蛋白酶-3 (1:1000; Cell Signaling Technology,9664), PARP(1:1000;Santa Cruz,SC8007)、裂解 PARP(1:1000;Cell Signaling Technology,9541S)、外皮蛋白(1:1000;Thermo Fisher,MS-126-P1ABX)、Bcl-2(1:1000;Cell Signaling Technology,15071S)、Bax(1:1000;Cell Signaling Technology,5023S)和 LC3(1:1000;Cell Signaling Technology,2775S)。然后用 ChemiDoc MP 成像系统(Bio-Rad)捕获对应于每个标记蛋白的化学发光信号。使用针对 GAPDH 的特异性抗体(1:10000;Proteintech,10494-1-AP)作为蛋白质上样对照。