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引文：Capdeville, N.、Schindele, P. 和 Puchta, H. (2020)。CRISPR/Cas 介导的碱基编辑在植物定向蛋白质进化中的应用
因此，已经开发出许多通过位点特异性DNA多样化实现基因及其产物定向进化的方法。其中许多方法，例如易错PCR、位点饱和诱变或嵌合体生成，都是基于序列文库的生成，然后在体外或体内筛选改良的蛋白质变体。然而，低转化率是这些方法的主要限制因素（Engqvist和Rabe，2019年）。使用可编程核酸酶的基因编辑方法的应用可以实现位点特异性的体内诱变，因此具有用于定向进化的潜力。目前，只有通过表征CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）/Cas9（CRISPR相关）系统，才能实现大规模的定向诱变，因为与以前的系统相比，该系统具有简单性、多功能性和高精度。
Schindele 等人 2022 - 增强基因编辑和......
Huang, T.-K.、Armstrong, B.、Schindele, P. 和 Puchta, H. (2021) 使用 CRISPR/SaCas9 和耐高温 LbCas12a 在烟草中实现高效基因靶向。植物生物技术杂志 19 , 1314–1324。Lawrenson, T.、Hinchliffe, A.、Forner, M. 和 Harwood, W. (2022)。使用新型 Lb Cas12a 变体在大麦中进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响。 biorxiv 10.1101/2022.04.28.489853v1 Malzahn, AA, Tang, X., Lee, K., Ren, Q., Sretenovic, S., Zhang, Y., Chen, H., Kang, M., Bao, Y., Zheng, X., Deng, K., Zhang, T., Salcedo, V., Wang, K., Zhang, Y. 和 Qi, Y. (2019) 应用 CRISPR-Cas12a 温度敏感性改进水稻、玉米和拟南芥的基因组编辑。BMC 生物学 17、9。Merker, L.、Schindele, P.、Huang, T.-K.、Wolter, F. 和 Puchta, H. (2020) 使用耐温 CRISPR/LbCas12a 增强拟南芥植物体内基因靶向效率。植物生物技术杂志 18 , 2382–2384。Schindele, P. 和 Puchta, H. (2020) 改造 CRISPR/LbCas12a 以实现高效、耐高温的植物基因编辑。植物生物技术杂志 18 , 1118–1120。Weiss, T.、Crisp, PA、Rai, KM、Song, M.、Springer, NM 和 Zhang, F. (2022) 表观遗传特征极大地影响了 CRISPR-Cas9 在植物中的功效。植物生理学。
四倍体马铃薯中可以实现主要编辑，但需要改进
Anzalone AV、Randolph PB、Davis JR、Sousa AA、Koblan LW、Levy JM、Chen PJ、Wilson C、Newby GA、Raguram A 等人 (2019) 无需双链断裂或供体 DNA 的搜索和替换基因组编辑。Nature 576：149–157 Bastet A、Zafirov D、Giovinazzo N、Guyon-Debast A、Nogué F、Robaglia C、Gallois JL (2019) 通过 CRISPR-Cas9 碱基编辑模拟 eIF4E 中的天然多态性与对马铃薯病毒的抗性有关。Plant Biotechnol J 17：1736–1750 Butt H、Rao GS、Sedeek K、Aman R、Kamel R、Mahfouz M 通过水稻中的 prime 编辑实现除草剂抗性工程化。Plant Biotechnology Journal。 doi: 10.1111/pbi.13399 Fauser F, Schiml S, Puchta H (2014) 基于 CRISPR/Cas 的核酸酶和切口酶均可有效用于拟南芥的基因组工程。Plant J 79 : 348–359 Henikoff S, Comai L (2003) 植物功能基因组学的单核苷酸突变。Annual Review of Plant Biology 54 : 375–401 Hua K, Jiang Y, Tao X, Zhu JK 利用 prime editing 系统对水稻进行精准基因组工程。Plant Biotechnology Journal。doi: 10.1111/pbi.13395 Huang TK, Puchta H (2019) CRISPR/Cas 介导的植物基因打靶：同源重组终于迎来转机。 Plant Cell Rep 38 : 443–453 Li H, Li J, Chen J, Yan L, Xia L (2020) 通过 Prime Editing 对水稻外源和内源基因的精确修改。Molecular Plant 13 : 671–674 Lin Q, Zong Y, Xue C, Wang S, Jin S, Zhu Z, Wang Y, Anzalone AV, Raguram A, Doman JL 等人 (2020) 水稻和小麦的 Prime 基因组编辑。Nat Biotechnol 38 : 582–585 Mishra R, Joshi RK, Zhao K (2020) 作物中的碱基编辑：当前进展、局限性和未来影响。 Plant Biotechnol J 18 : 20–31 Sevestre F, Facon M, Wattebled F, Szydlowski N (2020) 促进马铃薯基因编辑：Solanum tuberosum L. cv. Desiree 基因组的单核苷酸多态性 (SNP) 图谱。Sci Rep 10 : 2045
使用新型 Lb Cas12a 变体对大麦进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响 Tom Lawrenson、Alison Hinchliffe、Macarena
CRISPR、Cas12a、CPF1、大麦、诱变、单子叶植物、基因组编辑摘要我们报告了首次成功、高效使用大麦中的 Lb Cas12a，并描述了两种新型 Cas12a 变体的开发和应用。总共我们使用二十种不同的指南比较了五种编码序列 (CDS) 变体，包括两种新型变体和两种指南架构，针对 5 种不同的靶基因。我们发现不同 CDS 版本 (0-87%) 和指南架构 (0-70%) 之间的编辑效率存在很大差异，并且表明我们的两个新型 CDS 版本在该物种的测试中大大优于其他版本。我们展示了产生的突变的遗传性。我们的研究结果强调了优化单个物种的 CRISPR 系统的重要性，并可能有助于在其他单子叶植物中使用 Lb Cas12a。正文 毛螺菌科细菌 Cas12a (Lb Cas12a) 可能是继化脓性链球菌 Cas9 (Sp Cas9) 之后植物基因组编辑中第二广泛使用的可编程核酸酶，并且具有一些潜在优势。首先，由于其对 TTTV PAM 的要求与 NGG 的 Sp Cas9 要求不同，它可用于 GC 沙漠，而 GC 沙漠通常存在于内含子、UTR 和启动子区域中。其次，Lb Cas12a 通常比 Sp Cas9 产生更大的缺失，这可能在缺失研究中有用。第三，虽然 Sp Cas9 在靶标的 PAM 近端切割产生平端，但 Lb Cas12a 在 PAM 远端区域切割产生粘端；这两个特征可能解释了使用 Lb Cas12a 实现的基因靶向发生率更高 (Wolter 和 Puchta，2019)。已知在植物中起作用的三种版本的 Lb Cas12a 针对一个大麦靶标进行了测试。首先，是水稻优化的编码序列 (CDS) (Os Cas12a) (Tang et al., 2017)；其次是人类优化的 CDS (Hs Cas12a)，在双子叶植物中具有功能 (Bernabé-Orts et al., 2019)；第三是拟南芥优化的 CDS，包含 D156R“耐高温”突变 (tt At Cas12a) (Schindele and Puchta, 2020)。我们还创建了两个新版本，携带 D156R 突变的 Hs Cas12a (tt Hs Cas12a) 和携带 8 个内含子的 tt At Cas12 (tt At Cas12+int)。这些内含子之前曾显著提高过 Sp Cas9 的效率（Grutzner 2021），因此我们使用相同的在线工具（NetGene2 - 2.42 - Services - DTU Health Tech）在我们的 tt At Cas12+int 设计中为拟南芥选项获得了较高的剪接置信度。
使用CRISPR
从前发表的那些（Lin等人）修改了所使用的原生质体再生方案（图1）（图1），2018年； Hsu等。，2019年）。我们方法的关键是一个事实，即细胞周期的阶段在很大程度上控制了途径的选择。nhej是G1，S和G2阶段中的主要DNA修复途径，而HDR仅在晚期和G2阶段发生（Hiom，2010； Puchta和Fauser，2014）。细胞周期同步已有效提高人类胚胎肾脏293T细胞的Ti效率（Li等，2014）。为了增加晚期和G2相细胞，将烟叶孵育在含有½的强度MS，0.4 M甘露醇，1 mg/L脑苯甲甲基乙酸（NAA）和0.3 mg/l动力蛋白（1N0.3K）之前的固体培养基（1N0.3K），请在原生物分离之前三天（图S1）。在N. Benthamiana中，为了简化过程，我们添加1 mg/l naa和
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。