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开发和验证核酸生物标志物 qPCR 方法作为药物开发工具：需要考虑的要点
1 日本国立卫生科学研究所药物安全科学部，神奈川 210-9501，日本 2 新日本生物医学实验室有限公司，鹿儿岛 891-1394，日本 3 协和麒麟株式会社，静冈 411-8731，日本 4 武田药品工业株式会社，神奈川 251-8555，日本 5 CMIC Pharma Science 有限公司，山梨 408-0044，日本 6 三菱田边制药株式会社，神奈川 251-8555，日本 7 礼来日本株式会社，兵库县 651-0086，日本 8 日本药品制造商协会药物评估委员会临床评估小组委员会，东京 103-0023，日本 9 ASKA 制药株式会社日本神奈川县，251-8555 10 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd，茨城县，300-2611，日本 11 Nippon Shinyaku Co., Ltd，京都，601-8550，日本 12 Daiichi Sankyo Co., Ltd，东京，140-8710，日本 *通讯作者：电话：+81 44 270 6623; yoshiro@nihs.go.jp
通过实时定量PCR（QPCR）筛选食品和环境表面上沙门氏菌的方案（2023年11月28日）
这种FDA开发的QPCR方法适用于使用Applied Biosystems TM（ABI）7500快速实时PCR系统快速筛选食品和环境表面。该方法靶向沙门氏菌浸润基因（INVA），该基因已被证明与s的内在化有关。哺乳动物上皮细胞中的伤寒（1-4）。该基因被发现是沙门氏菌（3,5）独有的，其DNA序列在沙门氏菌属中高度保守。（2,4,6）。该方法使用定制设计的引物和塔克曼探针来扩增具有严格特异性的沙门氏菌特异性Inva基因的262 bp片段（7,8,9），并包括定制设计的内部扩增对照（9），这是识别通常在食物中发现的PCR抑制pCR抑制的虚假结果所需的。可以在BAM第5章E9（https://www.fda.gov/media/107724/107724/download）中找到使用此QPCR方法作为沙门氏菌分离株的验证性测定的协议。在我们的两项MLV研究中，QPCR方法被证明是一种可再现，敏感和特定的快速筛选方法（11）。在MLV婴儿菠菜研究中，qPCR方法的检测极限50（LOD 50）为0.811 cfu/ 25g，用于BAM培养方法的0.837 CFU/ 25G（13）。在MLV冷冻鱼类研究中，QPCR和培养方法的LOD 50为0.75 CFU/25G。使用QPCR方法作为快速筛选工具的协议如下所述。协议中的QPCR组件和数据分析是针对ABI 7500快速实时PCR系统的。This qPCR method has been shown to be an effective and rapid screening tool for a broad range of foods that includes fruits, fresh leafy green vegetables and herbs (blackberry, blueberry, raspberry, strawberry, baby spinach, cabbage, iceberg lettuce, romaine lettuce, spring mix, basil, cilantro, parsley, dill, oregano, watercress), low-moisture foods (almond, almond butter, chia seed powder, dried cereal, dried egg noodle, infant formula, peanut butter, pine nuts, soy formula, walnuts), seafoods (fish, shrimp, raw oyster), whole shell eggs, spices (crushed red pepper, ground basil, ground black pepper, ground cumin, ground white pepper, paprika, red chili powder), and environmental surfaces (plastic, stainless钢，陶瓷瓷砖，橡胶和铸铁）以及多个动物饲料（小鸡饲料，优质苜蓿颗粒，小麦麸，整燕麦），它们是在一系列SLV研究中用浸泡或混合程序制备的（7,8,9,10）。必须首先根据FDA微生物学方法验证指南（https://wwwww.fda.gov/media/83812/download）或其他国际认可的验证指南，例如AOAC International的Appendix j（httpp：htttp：htttp：/JAPF：标准化组织的16140：2 2016（www.iso.org）。
Air-Dryable 可风干粪便直扩DNA qPCR预混液产品处理指南
可风干粪便直扩 DNA qPCR 预混液采用干冰 / 蓝冰运输。到货后储存于 -20°C 下，以获得 最佳稳定性。应避免反复冻融循环。运输过程中解冻不影响产品性能。每次解冻后应混合 / 平衡溶液 以避免分相。 有效期： 在外包装盒标签上的有效期内，在推荐条件下储存并正确处理时，试剂盒可保持完整活性。 安全预防措施： 处理试剂前请阅读并理解 SDS （安全数据表）。首次发货时提供 SDS 的纸质版文件，此后可应要求提 供。 质量控制： Meridian 遵守 ISO 13485 质量管理体系运行。 Air-Dryable
Lyo-Ready 可冻干唾液直扩RNA/DNA qPCR 预混液产品 ...
可冻干唾液直扩 RNA/DNA qPCR 预混液采用蓝冰运输。到货后储存于 -20°C 下，以获得 最佳稳定性。应避免反复冻融循环。运输过程中解冻不影响产品性能。每次解冻后应混合 / 平衡溶液 以避免分相。 有效期： 在外包装盒标签上的有效期内，在推荐条件下储存并正确处理时，试剂盒可保持完整活性。 安全预防措施： 处理试剂前请阅读并理解 SDS （安全数据表）。首次发货时提供 SDS 的纸质版文件，此后可应要求提 供。 质量控制： Meridian Bioscience 遵守 ISO 13485 质量管理体系运行。 Lyo-Ready
优化的策略，用于实时qPCR检测池smulium sp。 blackfly矢量
1美国北安普敦史密斯学院生物科学系，美国美国，美国2号生物科学系，昆尼皮亚西亚三世大学，昆尼皮亚克大学，汉姆登，康涅狄格州，美国康涅狄格州，美国寄生疾病3实验室，美国国家医学院，美国伯兰群岛，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国，美国。 Missouri, United States of America, 5 Laboratory of Molecular Parasitology, Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, New York, United States of America, 6 Institute of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology, University Hospital Bonn, Bonn, Germany, 7 German Center for Infection Research (DZIF), Partner-Site Bonn-Cologne, Bonn, Germany, 8 Center for Global Health Infectious Disease Research, University of South Florida, Tampa, Florida, United States of America, 9 Parasite and Vectors Research Unit, Department of Microbiology and Parasitology, University of Buea, Buea, Cameroon, 10 Research Foundation in Tropical Diseases and the Environment, Buea, Cameroon, 11 NTD-SC, Task Force for Global Health, Atlanta, Georgia, United States of America, 12 RLMF, The END Fund, New York, New美国，美国，美国马萨诸塞州阿默斯特大学，美国马萨诸塞州阿默斯特大学的13分子和蜂窝生物学计划
电池供电的便携式旋转实时荧光 qPCR，能耗低、成本低、通量高
摘要：针对传统qPCR仪器体积大、价格昂贵、携带不便等问题，本文报道了一种便携式旋转式实时荧光PCR（聚合酶链式反应），可在现场完成DNA的PCR扩增，并可实时观察反应过程。通过对目的基因pGEM-3Zf(+)的分析，将梯度扩增曲线和熔解曲线与商用设备进行对比，结果证实了本装置的稳定性。这是首次利用机械旋转结构实现与商用仪器相媲美的梯度扩增曲线和熔解曲线。本系统平均功耗约为7.6 W，是分流PCR实时荧光定量中能耗最低的，且自带锂电池供电，可现场使用。此外，由于通过机械位移控制系统取代了传统的TEC（热电致冷器）控温，整套设备成本仅约710美元，远低于商用PCR仪成本，且设备技术门槛低，可适应非专业场合，重复性强。
在建筑饮用水系统中量化肺炎军团菌的定量：比较QPCR和基于培养的检测方法的荟萃分析
定量聚合酶链反应（QPCR）提供了一种快速，自动化和强大的现场方法，用于量化肺炎乳杆菌在构建饮用水系统中，补充并有可能替代传统的基于文化的技术。然而，由于发现与可行，传染性细菌无关的基因组副本，它在评估人类健康风险中的应用使人们越来越多。本研究通过QPCR和基于培养的方法研究了肺炎乳杆菌测量的关系，旨在建立QPCR与培养的浓度比率，以告知相关的健康风险。合格的研究使用成对水样品中的分子和基于培养的方法收集了有关肺炎乳杆菌浓度的定量数据。我们开发了一个泊松对数正态比率模型和一个随机效应荟萃分析模型，以分析跨站点内部和跨站点的QPCR培养比的变化。在系统评价中的17项研究中，有7项，包括23个特定地点数据集，用于荟萃分析。我们的发现表明这些比率通常从1：1到100：1不等，在所有地点的比率接近1：1。因此，采用默认的1：1转换因子似乎是必要的，作为一种谨慎的方法，将QPCR浓度转换为可培养的浓度，以用于健康风险模型，例如量化微生物风险评估（QMRA）。如果这种方法可能过于保守，则可活力-QPCR可以提高基于QPCR的QMRA的准确性。标准化QPCR和基于培养的方法以及影响肺炎乳杆菌可培养性的特定地点环境因素将改善对两种方法之间关系的理解。此处介绍的比率模型超出了简单的相关性分析，从而促进了关系中时间和空间异质性的研究。该分析是QMRA和分子生物学整合的一步，针对肺炎乳杆菌的框架适用于在环境中监测的其他病原体。
Lyo-Ready 可冻干唾液直扩DNA qPCR预混液产品处理指南
可冻干唾液直扩 DNA qPCR 预混液采用干冰 / 蓝冰运输。到货后储存于 -20 °C 下，以获得 最佳稳定性。应避免反复冻融循环。运输过程中解冻不影响产品性能。每次解冻后应混合 / 平衡溶液 以避免分相。 有效期： 在外包装盒标签上的有效期内，在推荐条件下储存并正确处理时，试剂盒可保持完整活性。 安全预防措施： 处理试剂前请阅读并理解 SDS （安全数据表）。首次发货时提供 SDS 的纸质版文件，此后可应要求提 供。 质量控制： Meridian 遵守 ISO 13485 质量管理体系运行。 Lyo-Ready
鉴定合适的QPCR参考基因，用于在Duchenne肌肉营养不良的BL10-MDX和D2-MDX小鼠模型中归一化基因表达
Duchenne肌肉营养不良（DMD）是一种X连锁疾病，是由DMD基因突变引起的，导致逐渐浪费肌肉和无力。目前无法治愈DMD。BL10-MDX小鼠是临床前DMD研究中最常用的模型，但与DMD患者相比，它表现出温和的疾病表型，从而限制了研究的可转换性。较新的D2-MDX小鼠在很小的时候就具有更严重的表型，并且可以更好地概括人类疾病。将这些小鼠模型与定量RT-PCR，稳定且可靠的参考基因进行比较是必不可少的。We aimed to evaluate the stability and reliability of a panel of nine candidate reference genes ( Actb, Ap3d1, Gapdh, Hmbs, Htatsf1, Pak1ip1, Rpl13a, Sdha and Zfp91 ) in the gastrocnemius, diaphragm and heart of mice from both strains and their corresponding wild types aged 4 to 52 weeks.使用Genorm，最佳门将，三角肌和Normfinder分析数据。我们发现HTATSF1，PAK1IP1和ZFP91是合适的参考基因，用于在营养不良和健康小鼠中基因表达的标准化，无论组织类型或年龄如何。在我们的手中，ACTB，GAPDH和RPL13A不适合作为参考基因，表现出组织，年龄或疾病特定的表达变化。这项研究强调了选择合适的参考基因的重要性，因为它们的稳定性在特定的实验设置之间可能有所不同。
用于基于 qPCR 的基因编辑的 CRISPY™ Master Mix ...
我们使用 All-in-one Cas9 构建体编辑了 HEK293 细胞中的 DNA (胞嘧啶-5-)-甲基转移酶 3 beta (DNMT3B) 基因，从编辑后的细胞中分离基因组 DNA，然后使用标准 (黄色曲线) 和 snapback 引物 (红色曲线，图 2A) 进行 CRISPY 测定以量化编辑成功率。我们还对从未编辑的细胞中分离的 DNA 进行了 CRISPY 测定，同样使用标准 (黄色曲线) 和 Snapback 引物 (红色曲线，图 2B)。正如预期的那样，标准引物在编辑和未编辑的 DNA 中均提供了强大的扩增，然而 snapback 引物仅在从编辑细胞中分离的 DNA 中提供了明显的扩增。标准和 snapback 引物之间的 ΔCt 可直接测量编辑成功率，而熔解曲线形状之间的差异表明编辑的 DNA 中存在缺失 (图 2C，方框区域)。