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基因编辑拯救 RAG2 的体外 T 细胞发育......
摘要 RAG1 或 RAG2 缺陷引起的严重联合免疫缺陷 (SCID) 是一种遗传决定的免疫缺陷，其特征是 T 和 B 淋巴细胞几乎不存在。除非接受造血干细胞移植 (HSCT) 治疗，否则 RAG 缺陷患者会在生命早期死于严重感染。然而，造血干细胞移植存在移植物抗宿主病的风险。此外，据报道，未经处理的造血干细胞移植后，移植物失败率高，免疫重建不良。RAG 基因的表达受到严格调控，使用异源启动子进行基因治疗的临床前尝试导致了有争议的结果。使用患者来源的诱导性多能干细胞 (iPSC) 和体外人工胸腺类器官系统作为模型，我们在此证明基因编辑可将 RAG2 缺陷细胞的 T 细胞分化潜能恢复到正常水平，并产生多样化的 T 细胞库。这些结果表明，有针对性的基因编辑可能代表一种纠正这种免疫缺陷的新型治疗选择。
高品质严重联合免疫缺陷 (SCID) 大鼠生物资源
免疫缺陷动物是外源组织植入的宝贵模型，广泛应用于人源化动物模型的建立、再生医学和肿瘤学等诸多领域。与小鼠相比，实验室大鼠体型较大，更容易接受各种组织器官的移植。考虑到缺乏优质的免疫缺陷大鼠资源，我们利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统，单独或联合敲除 F344/Jcl 大鼠的白细胞介素 2 受体γ 链基因 ( Il2rg )，以创建研究人员可以自由使用的优质生物资源：重症联合免疫缺陷 (SCID) 大鼠。选取Il2rg（5-bp del）和Rag2（[1-bp del+2-bp ins]/[7-bp del+2-bp ins]）同时发生移码突变的创始大鼠1只，进行交配，建立免疫缺陷大鼠系。Il2rg单敲除（sKO）和Il2rg/Rag2双敲除（dKO）大鼠均存在严重的胸腺发育不全，初步证实了免疫缺陷表型。外周血血细胞计数评估显示，sKO和dKO大鼠白细胞计数明显降低，红细胞计数不受影响。白细胞计数的减少主要是由于淋巴细胞的减少所致。此外，通过流式细胞术分析淋巴细胞群表明，在两只基因敲除大鼠中，B 细胞 (CD3 - CD45 + ) 和自然杀伤细胞 (CD3 - CD161 + ) 的数量均显著减少。相反，T 细胞显著减少，但在 sKO 和 dKO 大鼠之间结果略有不同。值得注意的是，我们的免疫缺陷大鼠没有表现出生长迟缓或配子发生缺陷。这种高质量的 SCID 大鼠资源现在由日本国家生物资源项目管理。我们的 SCID 大鼠模型已用于各个研究领域，证明了其作为生物资源的重要性。
sarco/内质网Ca2+-ATPase（SERCA）活性是V（d）J重组
全基因组CRISPR/CAS9屏幕鉴定出ATP2A2，该基因编码sarco/ca 2+ -ATPase（SERCA）2蛋白，对V（d）J重组很重要。SERCAS是ER跨膜蛋白，可将Ca 2+从胞质液泵入ER管腔中，以维持ER Ca 2+储层并调节胞质Ca 2+依赖性过程。在PERB细胞中，SERCA2的丢失导致V（D）J重组动力学减少，这是由于抹布介导的DNA裂解减少。B细胞中的SERCA2缺乏会导致SERCA3的表达增加，SERCA2和SERCA3的综合损失导致ER Ca 2+水平降低，胞质Ca 2+水平升高，RAG1和RAG2基因表达的降低以及V（D）J重组的深刻障碍。由杂合ATP2A2突变引起的SERCA2和人类缺乏B细胞的小鼠，成熟的B细胞数量减少。我们得出的结论是，SERCA蛋白调节细胞内Ca 2+水平以调节RAG1和RAG2基因表达以及V（D）J的重组以及SERCA功能的缺陷会导致淋巴细胞减少。
：生成以非人类灵长类动物肝细胞为预测的小动物模型的小鼠
1 Azuma等。“人类肝细胞在fah - / - /rag2 - / - /il2rg - / - 小鼠中的稳健膨胀。”自然生物技术（2007）。2冯·施文（Von Schaewen）等。“通过病毒适应扩大丙型肝炎病毒的宿主范围。”MBIO（2016。 3 Valenti等。 “ I148M多态性的纯合性影响非酒精性脂肪肝病患者的肝纤维化。” Hepatology（2010）。 4 Srinivasan等。 “肝磷酸合成酶1-缺乏的肝脏小鼠模型。” 遗传代谢疾病杂志（2019年）。 5 Hu，Huili等。 “功能小鼠和人肝细胞作为3D器官的长期扩张。” Cell（2018）。MBIO（2016。3 Valenti等。 “ I148M多态性的纯合性影响非酒精性脂肪肝病患者的肝纤维化。” Hepatology（2010）。 4 Srinivasan等。 “肝磷酸合成酶1-缺乏的肝脏小鼠模型。” 遗传代谢疾病杂志（2019年）。 5 Hu，Huili等。 “功能小鼠和人肝细胞作为3D器官的长期扩张。” Cell（2018）。3 Valenti等。“ I148M多态性的纯合性影响非酒精性脂肪肝病患者的肝纤维化。”Hepatology（2010）。 4 Srinivasan等。 “肝磷酸合成酶1-缺乏的肝脏小鼠模型。” 遗传代谢疾病杂志（2019年）。 5 Hu，Huili等。 “功能小鼠和人肝细胞作为3D器官的长期扩张。” Cell（2018）。Hepatology（2010）。4 Srinivasan等。“肝磷酸合成酶1-缺乏的肝脏小鼠模型。”遗传代谢疾病杂志（2019年）。5 Hu，Huili等。 “功能小鼠和人肝细胞作为3D器官的长期扩张。” Cell（2018）。5 Hu，Huili等。“功能小鼠和人肝细胞作为3D器官的长期扩张。”Cell（2018）。Cell（2018）。
意见增强剂的非规范函数：RNA聚合酶III转录，DNA复制和V（d）J重组的调节
增强子是其他基于DNA的过程的关键调节因子，因为它们以高度调节的方式产生核小体耗尽区域的独特能力。增强子通过RNA聚合酶III（POL III）调节TRNA基因的细胞类型特异性转录。他们还负责原点复制复合复合物（ORC）与DNA复制起源的结合，从而调节原点利用，复制时机和依赖复制的染色体断裂。此外，增强剂通过增加重组激活基因（RAG）重组酶对靶位点的访问以及通过产生由RAG2 PHD域识别的三甲基化组蛋白H3-K4的局部区域来调节V（d）J重组。因此，增强子代表了解码基因组的第一步，因此它们调节生物学过程，这些过程与RNA聚合酶II（POL II）转录不同，没有专用的调节蛋白。
罕见免疫疾病为基因组编辑铺平道路......
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 基因组编辑平台预示着基因治疗新时代的到来。针对危及生命的血液和免疫系统单基因疾病的创新疗法正在从半随机基因添加转变为对缺陷基因的精确修改。随着这些疗法进入首次人体临床试验，它们的长期安全性和有效性将为未来一代基于基因组编辑的医学提供参考。在这里，我们讨论了先天性免疫缺陷作为建立和推进精准医疗的疾病原型的重要性。我们将回顾基于成簇的规律间隔的短回文重复序列的基因组编辑平台修改原代细胞 DNA 序列的可行性，并描述两种新兴的基因组编辑方法来治疗 RAG2 缺陷（一种原发性免疫缺陷）和 FOXP3 缺陷（一种原发性免疫调节障碍）。
从 RAG1 产生抗原特异性成熟 T 细胞
多能干细胞 (PSC) 是现成免疫疗法中同种异体 T 细胞的有希望的来源。然而，分化基因工程 PSC 以产生成熟 T 细胞的过程需要去除对这些细胞的选择至关重要的相同分子元素，以防止同种反应。我们在这里展示了抗原限制性成熟 T 细胞可以在体外从通过 CRISPR 编辑的 PSC 中产生，这些 PSC 缺乏内源性 T 细胞受体 (TCR) 和 I 类主要组织相容性复合体。具体来说，我们使用了来自表达单个 TCR 的 RAG1 −/− RAG2 − /− B2M − /− 人类 PSC 的 T 细胞前体，以及提供同源人类主要组织相容性复合体分子和其他关键 T 细胞成熟信号的小鼠基质细胞系。可能由于没有 TCR 错配，产生的 T 细胞在小鼠中表现出比具有完整内源性 TCR 的 T 细胞更好的肿瘤控制。将 T 细胞选择成分引入 PSC 的基质微环境克服了与从同种异体 PSC 开发 T 细胞免疫疗法相关的固有生物学挑战。
低价锰原子在陶瓷上稳定为一氧化二氮合成
心肌和心律不齐的纤维化变化代表系统性硬化症（SSC）的致命并发症，但是基本机制仍然难以捉摸。小鼠过度表达转录因子FOSL-2（FOSL-2 TG）代表SSC的动物模型。Fosl-2 tg mice showed interstitial cardiac fi brosis, disorganized connexin-43/40 in intercalated discs and deregulated expression of genes controlling conduction system, and developed higher heart rate (HR), prolonged QT intervals, arrhythmias with prevalence of premature ventricular contractions, ventricular tachycardias, II-degree atrio-ventricular blocks并降低了人力资源变异性。用异丙肾上腺素FOSL-2 TG小鼠刺激后，HR反应受损。与FOSL-2 TG相比，免疫dim dim rag2 - / - fosl-2 tg小鼠受到增强的心肌纤维化和ECG异常的保护。转录组学分析表明，FOSL-2-ERVERSESS是造成心脏纤维细胞的纤维性特征的原因，而FOSL-2 TG小鼠中的炎症成分激活了它们的纤维性和心律失常的作用表型。在人类心脏纤维细胞中，FOSL-2超过表达增强了肌纤维细胞的签名，在proinmotal或pro粘连刺激下。这些结果表明，在免疫性条件下，转录因子FOSL-2夸大了肌纤维纤维肌，心律不齐和对压力的异常反应。
新的带状麻木（Characiformes
leporinus bleheri在玻利维亚和巴西之间的边界中描述了Guaporé-IténezBasin。最近，在马德拉盆地的不同河流中采样了相似的带状leporinus的标本。在这里，我们使用一种结合分子和形态数据的综合方法来研究新样本的分类状态。形态计量数据用于执行主成分分析（PCA）。两种物种标本均已清除并双重染色，用于骨学描述。DNA条形码用于研究样品与物种划界分析之间的遗传距离。分子标记COI，CYTB，16S，MYH6，RAG1和RAG2用于估计这两种物种的系统发育关系。我们的结果表明，Bleheri和新物种的样品之间的形态和遗传差异。在此描述并说明了这两个物种。通过在尾花序上有12个比例的行，将新物种与L. bleheri区分开（vs。16）。新物种和bleheri的遗传距离为3.93％，物种划界分析将样品恢复为分离的分子单位。多层分析证实了这两个物种之间的姐妹关系，包括它们在fasciatus fasciatus群中，后者被恢复为非单系。
在什么时机寄生虫攻击并消耗其宿主
图1。NPC的延迟移植可改善势后的长期移植物存活。（a）示意图显示了实验设计。免疫缺陷rag2 - / - 小鼠在1 dpi（急性）或7 dpi（延迟）处局部移植Rfluc表达NPC的局部移植。（b）激光多普勒成像证实中风后脑血流（CBF）减少。（c）中风诱导后2小时对CBF进行定量。（d）代表性的生物发光成像（BLI）说明了两组选定时间点的6周内NPC存活。（e）两组移植后的前3天内对BLI信号的定量。（g）在移植后7天使用EDU掺入的增生评估的示意性时间表，在42天（急性）和35天（延迟）移植后移植时进行染色，以跟踪移植物增殖。（h）在移植后7天，在35 dpi（延迟）和42 dpi（急性）天以35 dpi（延迟）和42 dpi（急性）天的7天和KI67 + NPC对EDU + NPC进行定量的代表性免疫荧光图像。（j）显示具有多能标记Nanog，NPC标记PAX6，Neuronal标记NEUN和星形胶质细胞标记GFAP的表型面板。（k）移植后六周移植的NPC（HUNU+）的代表性免疫荧光图像。比例尺：50µm。（l）急性移植组中移植物组成的定量。数据显示为平均分布，其中红点表示平均值。框图表示数据的25％至75％四分位数。总共使用了8只动物，每组4只动物。箱形图：图中的每个点代表一种动物。线图被绘制为平均值±SEM。使用未配对的Mann-Whitney U检验（C和E）或未配对的t检验（I）评估平均差异的显着性。统计显着性设置为 *，p <0.05； **，p <0.01; ***，p <0.001。